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背景:先天性无阴道是由于胚胎时期双侧副中肾管发育不全所至的疾病，目前的治疗以手术为主，术式多达20余种。目前无论何种术式，都存在或多或少的缺陷。阴道黏膜干细胞(vaginalmucosastemcells，VMSCs)来源于中胚层，属于成体干细胞的一种，在体内终生存在，具有强大的增殖能力，具有维持阴道黏膜上皮细胞的再生和修复的重要功能。分离富集患者自身的VMSCs做种子细胞，以人羊膜负载为支架构建人工阴道，用于创建一种新型的阴道成型术，有可能达到副作用少、创伤小、更符合生理要求的目标。
目的:用VMSCs构建人工阴道，建立小鼠模型，为进一步用患者自体的VMSCs治疗先天性无阴道的临床研究奠定基础。
方法:
一、VMSCs的分离、培养：1.滋养细胞的制备：植块法获得乳鼠成纤维细胞，接种培养至90％汇合后传代。取第3-5代成纤维细胞用丝裂霉素C处理，抑制其分裂增殖能力作滋养细胞；
2.原代人阴道黏膜上皮细胞的分离：用人阴道黏膜以胰蛋白酶、胶原酶混合消化法获得阴道黏膜上皮细胞；
3.阴道黏膜上皮细胞以3×105/L的密度种植于滋养细胞层上，每3天换液1次，培养至80-90％汇合后以多次差别消化法传代。
二、Ⅳ型胶原快速黏附法筛选VMSCs：1.Ⅳ型胶原快速黏附：取100μg/ml人Ⅳ型胶原0.3ml包被25cm的培养瓶，置4℃冰箱过夜；
2.PBS漂洗2次，洗去未贴壁的胶原；
3.将阴道黏膜上皮细胞用培养液分散成单细胞悬液，细胞密度为1×105/L，移入Ⅳ型胶原包被的培养瓶内，37℃培养箱静置20min；
4.PBS漂洗2次，将未黏附的细胞弃去；
5.黏附的阴道黏膜干细胞用0.25％胰酶+0.02％EDTA37℃消化5min，含血清培养液终止消化，1500rpm,离心5min，收集阴道黏膜干细胞冻存备用。
三、VMSCs的鉴定：1.将上述冻存的VMSCs解冻，PBS分散成单细胞悬液，细胞密度3×105/L，种植于滋养细胞层上，置37℃5％CO2培养箱培养，每3天换液1次。
2.用免疫细胞化学技术对VMSCs与原代人阴道黏膜上皮细胞进行抗角蛋白(cytokeratinsCK)CK10与抗CK19染色。
3.在400倍光镜下观察免疫细胞化学结果，每张切片随机选取10个视野，采用德国KONTRONIBAS2.5全自动图象分析系统，进行定量分析，计算平均阳性率。
4.流式细胞仪检测VMSCs与原代人阴道黏膜上皮细胞的细胞周期。
5.统计学处理：应用SPSS软件进行两组随机设计t检验，数据以-x±s表示。
四、羊膜负载VMSCs的观察：1.0.25％胰酶+0.02％EDTA37℃处理羊膜20min,将其上皮面朝上平铺于培养皿上，用无菌刮匙轻轻搔刮，直至显微镜下观察羊膜完全去除附着的上皮细胞。
2.将羊膜修剪成1.5×1.5cm×cm大小，上皮面朝上置于12孔板上。
3.将Ⅳ型胶原快速黏附法分选的阴道黏膜干细胞以5×105/cm2的密度接种在羊膜上皮面上，每3天换液1次，培养1周至细胞90％以上汇合。
五、构建人工阴道建立小鼠模型1.10％的水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠。
2.无菌条件下剪除裸鼠的全层阴道黏膜组织。
3.修剪已接种VMSCs的羊膜至1×0.5cm×cm大小，将羊膜基底面紧贴阴道腔覆盖在创面上，放置预先制备好直径0.2mm，长1cm的有孔橡皮管作阴道支撑模具。用8-0的血管缝线间断缝合阴道口外缘，固定羊膜及橡皮模具于阴道创面上。
4.每天用上皮细胞完全培养液灌洗裸鼠阴道腔。
六、人工阴道的鉴定1.HE染色观察裸鼠阴道腔VMSCs生长2周及6周的形态。
2.免疫组织化学技术检测裸鼠阴道腔VMSCs生长2周及6周CK的表达。
结果:
一、人阴道黏膜上皮细胞原代培养的结果：阴道黏膜上皮细胞以3×105/L的密度种植于滋养层细胞上，置25cm的培养瓶培养8-10天可达到80-90％汇合。
二、VMSCs鉴定的结果1.Ⅳ型胶原快速黏附法获得的VMSCs形状较小，呈均一的圆形，核浆比例较大，表现幼稚、未分化形态。种植于滋养层细胞上培养96h，可呈现椭圆形的细胞克隆形态，细胞排列紧密，由中央向四周扩展。消化分散成单细胞传代后能再次形成克隆。其克隆形成率达30-40％。
2.Ⅳ型胶原快速黏附法获得的VMSCs及原代阴道黏膜上皮细胞分别用免疫细胞化学技术进行抗CK10与抗CK19染色，其CK19阳性率分别为(65.5±13.58)％、(12.1±4.24)％，CK10阳性率分别为(10.84±2.41)％、(59.57±12.25)％，均有统计学差异(P＜0.05)。
3.Ⅳ型胶原快速黏附法获得的VMSCs及原代阴道黏膜上皮细胞分别用流式细胞仪进行细胞周期分析，其G0/G1的细胞比例分别为(96±1.76)％、(85.3±5.84)％，两者有统计学差异(P＜0.05)。
三、人羊膜负载VMSCs观察结果1.人羊膜用0.25％胰酶+0.02％EDTA37℃处理20min后在倒置显微镜下未发现上皮细胞生长。
2.种植于人羊膜上的VMSCs培养24小时即贴壁，培养6天达到90％汇合。
四、构建人工阴道的小鼠模型鉴定结果1.人羊膜负载的VMSCs在裸鼠阴道腔内种植14天，HE染色与抗人广谱CK免疫组化检测均可见零星的阴道黏膜上皮细胞生长，未形成片状。
2.种植42天，HE染色与抗人广谱CK免疫组化检测均可见阴道黏膜上皮细胞呈片状生长，表现复层鳞状上皮的形态，类似正常阴道的非角化复层鳞状上皮。
结论:
1.人阴道黏膜用胰酶、胶原酶混合消化法可获得大量阴道黏膜上皮细胞。
2.Ⅳ型胶原快速黏附法可筛选出较高纯度的呈未分化、形态幼稚、体外培养能形成克隆并具有慢细胞周期特性的VMSCs。
3.以人羊膜负载VMSCs移植入去除阴道黏膜的裸鼠体内，6周可构建出类似正常阴道的非角化复层鳞状上皮。