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ATP合酶(F1Fo-ATPase)是生物体中能量转换的关键酶。它存在于线粒体内膜、叶绿体类囊体膜和细菌的质膜上。ATP合酶能利用跨膜质子动力势合成ATP也能水解ATP形成生物体生活所需的质子梯度。不同来源的ATP合酶有着相似的亚基组成和结构特征。其中叶绿体ATP合酶可以根据结构和功能的不同分成两部分:镶嵌在膜内的CFo和突出在膜外的CF1。CFo形成跨类囊体膜的质子通道,并为CF1提供膜上的结合位点。CF1上有六个核苷酸结合位点,其中3个(亚基上的3个结合位点是催化位点,ATP合酶合成或水解ATP在CF1部分进行。本论文工作主要是研究叶绿体ATP合酶CF1部分三个小亚基(?、?(和??亚基)的结构和功能,进一步探索叶绿体ATP合酶亚基结构与功能的关系。1. 利用定点突变方法将玉米叶绿体ATP合酶?亚基第42位保守苏氨酸分别突变为半胱氨酸、精氨酸和异亮氨酸,并在E. coli中过量表达。包涵体经过变性、复性后依次通过DEAE纤维素柱和FPLC mono-Q柱纯化。纯化后的野生型?亚基具有与从叶绿体中提取的?亚基相当的生物活性(??)。突变体?T42C、?T42R和?T42I对CF1的Ca2+-ATPase 活性的抑制和对缺失?亚基的类囊体膜光合磷酸化活性的恢复都比野生型?亚基强,其中?T42I在这两个方面增益最强。远紫外圆二色光谱分析显示突变使?螺旋和?折叠的比例有些改变。这些结果表明玉米叶绿体ATP合酶?亚基42位苏氨酸在维持?亚基的结构和功能中起重要作用,同时也表明?亚基作为ATP合酶的抑制剂和质子门两个功能是相关的。2. 通过PCR方法将菠菜叶绿体ATP合酶(亚基N端分别缺失5、11、17、35个氨基酸残基,C端分别缺失3、9、15个氨基酸残基并分别克隆到质粒pGAD424中,同样通过PCR方法扩增菠菜叶绿体ATP合酶九个亚基的编码序列,分别克隆到质粒pGBT9中,双转化入酵母菌株HF7c 和SFY526,用酵母双杂交系统检测缺失对(亚基与叶绿体ATP合酶其它亚基间相互作<WP=6>用的影响。结果显示(亚基N端主要和CF1部分的其它亚基相互作用,而C-端主要与CFo部分的亚基相互作用。将N端缺失5、11个残基和C端缺失3、9个残基的(亚基突变体在E. coli中表达,纯化。纯化的(亚基突变体分别与游离CF1(-()及类囊体残缺膜进行重组,测定合酶水解ATP活性及重组类囊体膜循环光合磷酸化的活力。我们发现无论N端还是C端的缺失对CF1-ATPase水解ATP的活性没有明显影响,但是C端缺失明显影响了重组类囊体膜的循环光合磷酸化活力的恢复,而N端缺失对重组膜循环光合磷酸化活力的恢复没有特别影响。由此也可以看出,叶绿体ATP合酶(亚基的空间位置和作用与细菌的可能有所不同。3. 利用PCR方法将菠菜叶绿体ATP合酶?亚基N端分别缺失8、12、16、20、60个氨基酸残基。?亚基及其突变体能在E. coli中表达,并且可以和((复合物重组形成((?聚合物。聚合物((?WT表现出高的Mg2+-或Ca2+-ATPase活性。当?亚基?端缺失?个氨基酸残基时,聚合物(((???只有((?WT的Mg2+-或Ca2+-ATPase活性的30%左右。当?端缺失??个残基时,聚合物(((??20的水解ATP活性只有((?WT活性的??。另外还发现,?亚基对不同??亚基突变体与((复合物重组的((?聚合物水解ATP活性的抑制程度也有很大变化。这些结果表明叶绿体ATP合酶?亚基?端在稳定复合物和协同催化中是非常重要的。此外体外结合实验显示?亚基?端不是与?亚基结合的关键结构域。