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癌症是全世界范围内的一个主要的健康问题。因为有些肿瘤患者死于对现有的抗癌药物不敏感,或者在经过一定时间的治疗,对已有药物产生耐药性,所以在目前,研究和开发新的抗癌疗法和抗癌药物是有价值和迫切需要的。本论文的研究目的是在天然产物中发现抗癌的先导化合物并研究其体内和体外的作用效果和机理。背景与目的根据现有文献和我们以前的实验结果数据显示,在中药牛蒡子中,两个木脂素类化合物牛蒡子苷元和牛蒡子苷发现对一系列肿瘤细胞具有抗肿瘤作用。牛蒡子苷元,牛蒡的种子中发现的一种活性化合物,可以根除缺乏营养的肿瘤细胞。在除了它对不同肿瘤细胞株的广谱抗肿瘤活性结果,例如胰腺癌细胞系PANC-1和AsPC-1,牛蒡子苷元对于在葡萄糖剥夺条件下的癌细胞表现出一个高选择性细胞毒作用[91]。牛蒡子中的拉帕酚B,拉帕酚A和异拉帕酚A对于白血病K562细胞的IC50分别为38.5μg/ml,53.5μg/ml,51.1μg/ml[137]。因此,研究牛蒡子中木脂素类化合物的抗肿瘤活性及作用机理,从而发现安全有效地抗肿瘤先导化合物仍具有十分重要的意义。方法(1)牛蒡子提取物氯仿部位经由正相硅胶,SephadexLH-20凝胶色谱,ODS-B反相硅胶色谱分离出牛蒡子苷,牛蒡子苷元和LappaolF。用波谱解析的方法,对其结构进行了鉴定。对所有分离的化合物的光谱数据进行了测定;在TU-1901紫外光谱仪(普析通用,中国)上测定紫外吸收光谱;在API 2000的LC/MS/MS测量设备测定电喷雾电离-质谱(ESI-MS);在Bruker drx-400记录1H和13C核磁共振谱(NMR),以四甲基硅烷(TMS)仪器使用作为内标。(2)牛蒡子苷元,牛蒡子苷,和LappaolF,采用MTT法和平皿克隆法对肿瘤细胞株进行药效学检测。通过流式细胞仪测定细胞周期。蛋白质印迹法法分析研究化合物作用机理。(3)在HeLa肿瘤细胞荷瘤裸鼠体内对Lappaol F,牛蒡子苷和牛蒡子苷元进行药效学试验。结果1.牛蒡子中木脂素类化合物的制备。通过各种色谱方法分离得到牛蒡子中的三个化合物,1-3。通过光谱解析,结合化合物的薄层层析结果和紫外光谱数据,与文献1H和13C NMR数据比较,化合物1-3分别被确定为牛蒡子苷元,LappaolF和牛蒡子苷。通过戴安P680型高效液相色谱仪进行纯度测定。测定条件:PDA-100二极管矩阵检测器设定吸收波长为280 nm。色谱柱为菲罗门Luna,柱长4.6 x 150mm,柱填料孔径5μm,柱温35℃,甲醇和水为流动相,比例为47%的甲醇和53%水(体积/体积),流速1.0mL/min。LappaolF的出峰时间在15.93分钟。2.牛蒡子木脂素的体外抗肿瘤药效学研究LappaolF呈时间和剂量依赖性抑制肿瘤细胞增殖,对MCF-7,MDA-MB-231和RKO细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为13.3,16.8和25.2μM。同时,LappaolF对人正常乳腺MCF-10A细胞,3天或治疗时间延长到6天处理时表现出极小的细胞毒性。3.Lappaol F的抗肿瘤作用机制.流式细胞仪分析结果表明,Lappaol F显著增加了 2N G1期细胞比例或4N G2/M期细胞比例。在MCF-7和HeLa细胞中,细胞主要被主要阻滞在2N G1期。实验结果显示,LappaolF处理的MCF-7细胞中在G1期观察到的数量显著的增加(从65%到87%);Lappaol F处理的HeLa细胞中在G1期观察到的数量显著的增加(从56%至67%)。同时,LappaolF处理的HeLa细胞中在G1前期观察到的数量也显著的增加(从1%至15%)。在MDA-MB-231和RKO细胞中,细胞主要被主要阻滞在4N G2/M期。实验结果显示,LappaolF处理的MDA-MB-231细胞中在G2期观察到的数量显著的增加(从21%到45%);Lappaol F处理的RKO细胞中在G2期观察到的数量显著的增加(从19%到 71%)。研究结果表明,LappaolF的分子机制是通过调节细胞周期依赖蛋白阻滞剂的表达水平来诱导细胞周期阻滞。实验显示,Lappaol F处理的MCF-7细胞,CDK抑制剂p21和p27蛋白的表达水平明显升高,而CDK2,cyclinB和CDK1的水平都显著下降。Lappaol F处理的HeLa细胞,CDK抑制剂p21和p27蛋白的表达水平明显升高,而cyclinB和CDK1的水平都显著下降。LappaolF处理的MDA-MB-231细胞,CDK抑制剂p21和p27蛋白的表达水平明显升高,而CDK2,cyclin B和CDK1的水平都显著下降。LappaolF处理的RKO细胞,CDK抑制剂p21和p27蛋白的表达水平明显升高,而cyclinB和CDK1的水平都显著下降。机理研究表明,LappaolF可以有效地使肿瘤细胞阻滞在G1和G2期。LappaolF也改变了调节细胞周期的关键调节蛋白p21和p27的表达,从而使CDK2,cyclin B和CDK1的水平都显著下降。因此,Lappaol F是很好的抗肿瘤的先导化合物。4.Lappaol F的体内抗肿瘤药效学研究天然产物的活性成分的体外筛选和机制研究为其称为候选药物提供了基础,但它还需要进行体内的药效学研究。在前一节中,确定了中药来源的抗肿瘤先导化合物Lappaol F在多种肿瘤细系中具有抗肿瘤作用并对其机理进行了研究。接下来我们进行了 LappaolF的抗肿瘤体内药效学试验。对雌性裸鼠皮肤用75%乙醇消毒,用1ml、5号针头的注射器皮下注射100μL HeLa肿瘤细胞悬浮液(5X107细胞/mL),建立肿瘤异种移植模型。观察裸鼠情况,是否有悬浮液泄漏,出血,血肿,呼吸等生命体征。肿瘤细胞注射9天后,裸鼠的肿瘤平均体积为90 mm3-290 mm3,随机分为3组,每个治疗组小鼠的肿瘤体积平均初始分别为161.28±23.9 mm3(vehicle),160.7± 17.7 mm3(Lappaol F 5 mg/kg)和 144.5±20.5 mm3(Lappaol F 10 mg/kg)。Vehicle 组:等量DMSO加吐温80在5%葡萄糖溶液中,5 mg/kg/d,N = 7,尾静脉注射15天。Lappaol F 预防剂量组:5mg/kg/d,N = 7,尾静脉注射 15 天。Lappaol F组:10mg/kg/d,N =6,尾静脉注射15天。在实验中,Lappaol F处理的HeLa细胞荷瘤裸鼠的肿瘤生长比用空白溶剂处理的荷瘤裸鼠中的要缓慢。经过15天给药期间,在LappaolF处理过的小鼠的肿瘤体积为 634.8±54.9(LappaolF10mg/kg)和 820.3±86.0mm3(LappaolF5mg/kg),远小于溶剂对照组肿瘤体积为1765.3± 91.8mm3(P<0.001)。在实验结束时,对比各组裸鼠的剥离肿瘤平均重量。在肉眼观察下,肿瘤在Lappaol F给药组小于溶剂对照组。肿瘤重量在Lappaol F给药组分别为0.40±0.07g(10mg/kg)和0.53±0.07g(5mg/kg),与对照组相比,统计学上有显著差异。在给药过程中,LappaolF和空白对照组相比,动物体重没有明显下降。在本实验中,Lappaol F显著抑制肿瘤的生长,荷瘤裸鼠没有任何可观察到的毒性或副作用。LappaolF治疗的小鼠与空白对照组的裸鼠有相似的体重曲线。给药15天后,LappaolF的两个剂量组与空白对照组体重增加相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Lappaol F给药15天后,与空白对照组比较,抑制肿瘤的生长达到54%(5 mg/kg/day,P<0.001,N = 7)和 64%(10mg/kg/day,P<0.001,N = 6)。同时这个结果也表明,增加Lappaol F的剂量从5 mg/kg/day,到10 mg/kg/day,可以进一步减少荷瘤裸鼠的肿瘤体积和重量。更加重要的是,我们在Lappaol F(5 mg/kg/day和10 mg/kg/day)给药组,在15天的治疗期中没有观察到裸鼠鼠中的死亡或体重减轻。这些结果表明,Lappaol F可以抑制HeLa荷瘤裸鼠肿瘤的生长以及裸鼠对Lappaol F具有良好的耐受性。4.Arctiin和Arctigenin的体内抗肿瘤药效学研究在对牛蒡子中木脂素成分Lappaol F的体外抗肿瘤药效学、机制研究和体内药效学研究后,因为和其有相似的化学结构,我们有必要了解Arctiin和Arctigenin这两个牛蒡子中主要成分的抗肿瘤体内作用。对雌性裸鼠皮肤用75%乙醇消毒,用1ml、5号针头的注射器皮下注射100μL HeLa肿瘤细胞悬浮液(5×107细胞/mL),建立肿瘤异种移植模型。观察裸鼠情况,是否有悬浮液泄漏,出血,血肿,呼吸等生命体征。裸鼠的肿瘤平均体积为60 mm3-340 mm3,随机分为4组,每个治疗组小鼠的肿瘤体积平均初始分别为 143.2 ± 21.8 mm3(vehicle),135.4 ± 28.3 mm3(Arctigenin 15 mg/kg),139.3±19 7 19.7mm3(Arctiin15mg/kg)和 141.1±17.6 mm3(Arctiin30mg/kg)。Vehicle组:等量DMSO加吐温80在5%葡萄糖溶液中,5mg/kg/d,N = 9,腹腔注射14天。Arctigenin 组:15mg/kg/d,N = 9,腹腔注射14 天。Arctiin 低剂量组:15mg/kg/d,N=9,腹腔注射14天。Arctiin高剂量组:30mg/kg/d,N = 9,腹腔注射14天。在实验中,Arctiin和Arctigenin处理的HeLa细胞荷瘤裸鼠的肿瘤生长比用空白对照处理的荷瘤裸鼠中的要缓慢。经过14天给药期间,在Arctiin处理过的裸鼠的肿瘤体积为 733.3±88.4(Arctiin30mg/kg)和 795.6±82.9mm3(Arctiin15mg/kg),在Arctigenin 处理过的裸鼠的肿瘤体积为 711.7± 104.9 mm3(Arctigenin 15 mg/kg),远小于溶剂对照组肿瘤体积为1351.7± 122.1 mm3(P<0.001)。我们在 Arctiin(15 mg/kg/day 和 30 mg/kg/day)给药组,Arctigenin(15 mg/kg/day)给药组在15天的治疗期中没有观察到裸鼠鼠中的死亡或体重减轻。这些结果表明,Arctiin和Arctigenin可以抑制HeLa荷瘤裸鼠肿瘤的生长以及裸鼠对Arctiin和Arctigenin具有良好的耐受性。结论与创新1.本研究从牛蒡子的木脂素类成分发现一种新型抗癌先导化合物,Lappaol F。Lappaol F呈时间和剂量依赖性抑制多种生长在人类的各种组织类型的肿瘤细胞株。本研究首次发现:Lappaol F在MCF-7,MDA-MB-231和RKO细胞系的IC50值的为13.3,16.8,25.2 μM。2.本研究首次发现:Lappaol F引起细胞周期G1和G2期阻滞,可以较强的诱导细胞周期依赖蛋白抑制剂p21和p27表达上升,CDK2,cyclin B1和CDK1表达降低。Lappaol F调控的CDK1,cyclin B下降引起的细胞阻滞中,p21和p27起到了至关重要的作用。3.本研究首次对Lappaol F在体内抗肿瘤作用进行研究,并且本研究首次发现,Lappaol F在HeLa肿瘤荷瘤裸鼠体内表现出强烈抑制肿瘤增长作用,且实验动物对其表现出良好的耐受性。实验前,裸鼠肿瘤平均体积144.5 ± 22.4(Lappaol F 10 mg/kg),160.7 ± 19.1(Lappaol F 5 mg/kg)和 161.28 ± 25.8 mm3(空白对照组)。给药 15 天后,Lappaol F 给药组为 634.8 ± 60.1((Lappaol F 10 mg/kg)和 820.3 ± 92.9 mm3((Lappaol F 5 mg/kg),空白对照组肿瘤体积为1765.3 ±99.2 mm3,给药组与对照组相比,统计学上有显著差异(P<0.01).4.本研究首次发现:Arctiin和Arctigenin在荷瘤裸鼠体内对HeLa肿瘤有生长抑制效果。实验前,裸鼠肿瘤平均体积 141.1 ± 17.6(Arctiin 30 mg/kg),139.3 ± 19.7(Arctiin 15 mg/kg)and 135.4 ± 28.3 mm3(Arctigenin 15 mg/kg),143.2 ± 21.8 1mm3(空白对照组)。给药 14 天后,Arctiin 给药组为 733.3 ± 88.4 mm3(arctiin 30 mg/kg)和 795.6 ± 82.9 mm3(Arctigenin 15 mg/kg),Arctigenin 组为 711.7 ± 104.9 mm3(Arctigenin 15mg/kg),空白对照组肿瘤体积为1351.7± 122.1 mm3,给药组与对照组相比有统计学意义(P<0.05).