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背景:糖尿病心肌损伤是糖尿病的常见并发症之一,也是糖尿病患者心力衰竭发生率高和死亡率高的主要原因,其特征性病理改变包括心肌细胞肥大、肌原纤维缺失、间质纤维化、心肌内微血管病变等。当前研究表明,高血糖、脂质沉积、氧化应激、钙稳态失衡、线粒体功能障碍、肾素-血管紧张素系统激活、心肌炎症、细胞凋亡等在糖尿病心肌损伤中发挥重要作用。硫化氢(H2S)是继一氧化氮和一氧化碳以外发现的第三种气体信号分子,它是在磷酸吡哆醛-5’-磷酸依赖性酶(包括胱硫醚-β-合成酶和胱硫醚-γ-裂解酶)催化下以半胱氨酸作为底物生成的。近年来研究表明,H2S在心血管生理学和病理生理学方面发挥重要作用。H2S通过保护线粒体功能减轻心肌缺血再灌注损伤,同时能够降低缺血性心力衰竭的发生率和死亡率。内源性H2S生成减少的患者容易出现血管重构和早发动脉粥样硬化。在本实验中,我们采用链脲霉素诱导建立糖尿病大鼠模型,研究H2S对糖尿病诱导心肌损伤的保护作用及相关机制。方法:我们通过腹腔注射链脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型,然后将SD大鼠随机分成4组,共饲养16周,具体分组情况如下:1 Na HS组(正常大鼠腹腔注射Na HS溶液14μmol/kg.d);2 DM组(糖尿病大鼠腹腔注射等量的生理盐水);3 DM+Na HS组(糖尿病大鼠腹腔注射Na HS溶液14μmol/kg.d);4对照组(正常大鼠腹腔注射等量的生理盐水)。采用亚甲蓝法检测大鼠血浆和心肌组织中H2S含量;运用超声心动图检测大鼠的心脏结构和功能;取大鼠左心室组织,进行HE染色和Masson染色,分别计算心肌细胞横截面积和胶原容积分数;运用免疫组化法检测大鼠心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达;采用ELISA法检测大鼠心肌组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-8的含量;检测大鼠心肌组织中丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性;应用凝胶迁移实验检测大鼠心肌组织Nrf2-ARE的结合力;运用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡;采用ELISA法检测心肌组织中PI3K活性;运用Western blot检测心肌组织中Nrf2、HO-1、NQO1、Bax、Bcl-2、caspase-3的表达以及JNK(Thr183/Tyr185)、P38(Thr180/Tyr182)、Akt(Ser473)、Bad(Ser136)、caspase-9(Ser196)的磷酸化。心肌细胞经100μmol/L Na HS预处理30 min后,置于30 mmol/L高糖培养液中培养24 h,然后检测细胞内活性氧(ROS)含量,细胞经Annexin V/PI染色后于流式细胞仪上检测凋亡率。为了证实H2S通过激活Nrf2通路减轻高糖诱导的氧化应激,我们用Nrf2 si RNA转染心肌细胞,经Na HS预处理后置于高糖培养液中培养24 h,然后检测心肌细胞中Nrf2核蛋白表达和ROS含量。为了证实H2S通过抑制MAPK通路和激活PI3K/Akt通路而减轻高糖诱导的细胞凋亡,我们分别用JNK抑制剂SP600125(10μmol/L)、p38抑制剂SB203580(20μmol/L)和PI3K抑制剂LY294002(10μmol/L)预处理心肌细胞60 min,置于高糖培养液中培养24 h,然后检测JNK、p38、Akt的磷酸化水平和心肌细胞凋亡率。结果:1糖尿病大鼠血浆和心肌组织中H2S含量降低,而外源性补充Na HS能够增加糖尿病大鼠体内H2S浓度。2糖尿病大鼠可表现出心脏增大、室壁增厚、心肌纤维化、心功能不全等,而H2S能够减轻糖尿病大鼠心肌肥大和间质纤维化,改善左心室功能。3糖尿病大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量增加,而H2S能够减轻糖尿病大鼠心肌炎症反应。4糖尿病大鼠心肌组织中MDA含量增高,SOD、GSH-Px活性降低,而H2S能够减轻糖尿病大鼠心肌氧化应激水平。5H2S能够增加糖尿病大鼠心肌组织中Nrf2-ARE结合力,促进Nrf2核转移,上调抗氧化蛋白HO-1与NQO1的表达,从而减轻糖尿病大鼠心肌氧化损伤。6Na HS预处理能够激活Nrf2通路,减少高糖诱导下心肌细胞ROS产生;而Nrf2 si RNA转染的心肌细胞经Na HS预处理后不能减少高糖诱导的ROS生成,说明H2S减轻高糖诱导的氧化应激依赖Nrf2通路的激活。7糖尿病大鼠心肌细胞凋亡增加,心肌组织中Bax、caspase-3表达上调,Bcl-2表达下调;而外源性补充Na HS能够降低糖尿病大鼠心肌细胞凋亡指数及Bax/Bcl-2比率,表明H2S可能通过抑制线粒体凋亡通路而减轻高血糖诱导的心肌细胞凋亡。8糖尿病大鼠心肌组织中JNK、p38磷酸化水平增高,而H2S能够抑制糖尿病大鼠心肌组织MAPKs的磷酸化。9高糖能够诱导心肌细胞凋亡,Na HS预处理能够抑制JNK、p38通路,减少心肌细胞凋亡;心肌细胞分别经SP600125、SB203580预处理后,置于高糖培养液中培养,细胞凋亡率明显下降,表明H2S可能通过抑制JNK、p38通路而减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡。10糖尿病大鼠心肌组织中PI3K活性以及Akt、caspase-9、Bad的磷酸化水平降低,而H2S能够激活糖尿病大鼠心肌组织PI3K/Akt通路,促进凋亡调节蛋白caspase-9、Bad的磷酸化。?Na HS预处理能够激活PI3K/Akt通路,减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡;心肌细胞先后经LY294002、Na HS预处理后,置于高糖培养液中培养,细胞凋亡率未见明显下降,表明H2S可能通过激活PI3K/Akt通路而减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡。结论:H2S能够抑制糖尿病大鼠心肌组织炎症反应、氧化应激和细胞凋亡,从而减轻糖尿病诱导的心肌损伤。H2S可能通过激活Nrf2/ARE通路减轻高糖诱导的氧化应激,也可通过抑制JNK、p38通路或激活PI3K/Akt通路减轻高糖诱导的细胞凋亡。