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研究背景胰腺癌起病隐匿,发展迅速,是预后最差的消化道恶性肿瘤,其高度侵袭、转移的特性以及对化疗的不敏感性,使其整体5年生存率仍不到1 0%。胰腺癌的肿瘤微环境（tumor micro-environment,TME）十分特殊,表现为大量免疫细胞浸润,而癌细胞所占比例不足30%。近年研究表明,以TME为靶点可有效提高胰腺癌化疗的有效率,这也成为目前国内外研究的热点。但迄今为止,人们尚未在TME中构建出与胰腺癌患者预后相关的多因子调控网络,故通过大数据挖掘和肿瘤基因组图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）建立TME中多因子调控网络可帮助指导胰腺癌的个体化治疗及提高预后。另一方面,已知肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）在胰腺癌TME的免疫浸润细胞中所占比例最大,而在胰腺癌的进展及化疗耐药中起到至关重要的作用,结合本课题组在TAM领域所作前期研究及铺垫,对吉西他滨化疗刺激的胰腺癌细胞与M2型TAM共培养的胰腺癌细胞共同进行蛋白质质谱分析,结果发现胰腺癌细胞可能通过吉西他滨及TME中肿瘤相关巨噬细胞的刺激分泌干扰素刺激蛋白20（interferon-stimulated gene of 20 kDa protein,ISG20）,从而对胰腺癌的发生发展起促进作用。目前已报道ISG20在多种肿瘤及免疫反应中发挥重要作用,但未见其与胰腺癌发生发展及化疗耐药方面的研究工作。因此本论文在对胰腺癌TME,尤其是免疫细胞及因子调控与胰腺癌预后进行生物信息学的综合分析外,并同时进行已知的相关蛋白ISG20与胰腺癌细胞的生物学行为的关系及指导临床意义的研究。研究目的构建胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络进而挖掘对胰腺癌患者预后有价值的调控分子。探索TME中潜在治疗靶点ISG20对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移、化疗耐药等恶性生物学行为的调控作用,以及其下游调控的信号通路,明确ISG20在胰腺癌组织中的表达水平及其诊断和预后价值。研究方法一、胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络模型的构建利用Kaplan-Meier法进行生存分析;用Limma包进行差异分析,并通过显著性筛选得到差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）;用 KOBAS 数据库对DEGs进行通路富集分析;用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络;并进行富集分析;用Cytoscape软件对基因网络中的关键基因进行筛选和模块挖掘及网络拓扑关系分析。二、胰腺癌肿瘤免疫微环境中潜在治疗靶点ISG20的作用及机制研究1.利用细胞增殖实验、Transwell、细胞毒性实验测定胰腺癌细胞的生物学行为;2.利用RNA-seq等方法筛选ISG20下游靶点;3.利用免疫组化染色,对胰腺癌中ISG20的表达与患者临床病理特征之间的关系及其预后价值进行分析评估。研究结果一、胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络模型的构建1.TCGA数据库的胰腺癌队列中,免疫评分Ⅱ期>Ⅲ/Ⅳ期>Ⅰ期;2.免疫评分低的胰腺癌患者比高免疫评分的患者相比,5年生存率显著更长;3.模块挖掘得到的与胰腺癌及其他肿瘤预后相关的基因包括:CXCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11、PPY、LPAR3、HCAR3、ANXA1、SSTR1、SSTR5、INSL5、CCL28、KISS1R 以及 P2RY2;4.对胰腺癌预后相关基因具有显著调控作用的非编码RNA-pivot节点包括:WSPAR、hsa-miR-4425、hsa-miR-4536-5p、hsa-miR-410-5p、hsa-miR-8064、hsa-miR-6871-5p、hsa-miR-4767、hsa-miR-608、hsa-miR-4481 以及 hsa-miR-3605-3p;5.对胰腺癌预后相关基因具有显著调控作用的转录因子-pivot节点包括:RFWD2、GATA6、CITED2、PER2、TGIF1、RARA 以及 NR5A1;6.对胰腺癌具有潜在治疗效果的药物-pivot节点包括:Fibrinolysin、Urokinase、Pasireotide、Octreotide、Lutetium Lu 177 dotatate、Tenecteplase、Amcinonide、Botulinum Toxin Type A、HspE7 以及 Lanreotide。二、胰腺癌肿瘤免疫微环境中潜在治疗靶点ISG20的作用及机制研究1.ISG20对胰腺癌恶性生物学行为的调控ISG20可显著促进胰腺癌细胞体外及体内的侵袭转移能力,并降低胰腺癌细胞对吉西他滨化疗药的敏感性,但不影响胰腺癌细胞的体外增殖能力。2.ISG20对胰腺癌恶性生物学行为调控的分子机制研究通过筛选得到α3整合素（integrin alpha 3,ITGA3）分子,在进行瞬时敲减后,发现 β1 整合素（integrin beta 1,ITGB1）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）及其第185位点的酪氨酸磷酸化水平均显著降低,而平衡型核苷转运载体-1（equilibrative nucleoside transporter 1,ENT1）表达水平显著升高。3.ISG20在胰腺癌组织中的预后价值ISG20的表达水平与患者的预后相关,ISG20高表达患者的总体生存期显著短于低表达者。研究结论一、胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络模型的构建1.构建了胰腺癌免疫微环境核心预后相关因子网络,包括与胰腺癌预后相关的DEGs、对预后相关基因具显著调控作用的非编码RNA、转录因子及具潜在治疗效果的药物;2.本研究基于大数据挖掘的预后相关因子不仅可在胰腺癌的发生发展过程中起重要作用,还有助于改善胰腺癌治疗和评估患者预后、早期诊断和个体化治疗。二、胰腺癌肿瘤免疫微环境中潜在治疗靶点ISG20的作用及机制研究1.ISG20可显著促进胰腺癌细胞的侵袭转移能力以及对吉西他滨化疗耐药能力;2.ISG20通过激活α3β1-JNK-ENTI发挥作用;3.ISG20高表达预示不良预后,可作为潜在的治疗靶点。