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目的:观察Neuritin表达降低对Neuralized介导的Notch信号途径的影响,探讨Neuritin在神经再生及神经系统可塑性中的作用机制。
方法:
(1)Neuritin高表达细胞株的筛选:应用RT-PCR技术检测293T细胞及L-02细胞中neuritin基因的表达水平。
(2)PBS/U6-neuritin siRNA(1-3)表达载体的构建:应用基因工程的方法以PBS/U6为空载体,通过两步法构建PBS/U6-neuritin siRNA干扰质粒。
(3)PBS/U6-neuritin siRNA干扰质粒的鉴定:PBS/U6-neuritin siRNA干扰质粒转染Neuritin高表达细胞株,Western-blot检测细胞中Neuritin的表达,鉴定干扰载体的干扰效率。
(4)Neuritin siRNA对Notch信号途径配体Jaddeg1蛋白表达水平的影响:利用脂质体介导法共转染pIRES-HA-JAG1与PBS/U6-neuritin siRNA-(1-3)与293T细胞中,Western-blot检测Neuritin蛋白表达降低时,Jaddeg1蛋白的表达水平。
(5)Neuritin siRNA对Jaddge1蛋白内吞的影响:利用细胞内荧光定位技术观察细胞内Neuritin蛋白表达降低时,Jaddge1蛋白的内吞情况。
结果:
(1)RT-PCR结果显示:Neuritin蛋白在293T细胞及L-02细胞中高表达,选择293T细胞为实验细胞株。
(2)载体构建及干扰效率鉴定结果:PBS/U6-neuritin siRNA1-3载体经测序鉴定后,Western-blot结果显示neuritin干扰质粒可使293T细胞内源性Neuritin表达降低。
(3)Neuritin siRNA对Jaddeg1蛋白表达水平的影响:Western-blot结果显示,阻断Neuritin的表达,细胞中Jaddeg1蛋白表达水平下调。
(4)Neuritin siRNA对Jaddge1蛋白内吞的影响:Neuritin蛋白表达降低引起Jaddeg1蛋白内吞增加。
结论:
(1)Neuritin蛋白表达降低可以导致Notch信号途径配体Jaddeg1蛋白的表达下调。
(2)Neuritin蛋白表达下调可使Jaddeg1蛋白的内吞增加。
综上所述:Neuritin是Notch信号途径配体Jaddeg1蛋白的负调控因子,可能通过影响Jaddeg1蛋白的表达和内吞影响Notch信号途径。