论文部分内容阅读
D-核糖是一种具有重要生理生化功能的五碳糖，广泛存在于动物、植物和微生物的细胞中，是生物体内核酸、辅因子和维生素等的组成部分。此外，D-核糖具有巨大的经济价值，被广泛应用于食品医药领域，用来合成核黄素及抗病毒和抗癌药物。本课题采用转酮醇酶缺失的枯草芽孢杆菌EC2发酵生产D-核糖，其生物合成途径是葡萄糖通过氧化磷酸戊糖途径合成5-磷酸核糖，转酮醇酶缺失阻断了磷酸戊糖途径，积累5-磷酸核糖，5-磷酸核糖进一步去磷酸化生成D-核糖。
本研究首先对枯草芽孢杆菌EC2的形态及生理生化特征进行考察。该菌株在生长过程中会形成链状结构，丧失芽孢形成能力。枯草芽孢杆菌EC2是芳香族氨基酸营养缺陷型，只有在补充酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的基本培养基以及复合培养基中才能生长，不能在以D-葡萄糖酸、D-木糖、D-核糖为唯一碳源的基本培养基中生长。通过摇瓶实验，考察金属离子对D-核糖生产的影响，发现加入适量Mg2+离子、Mn2+离子和CaCO3能改善D-核糖生产。在发酵过程中，研究不同培养条件对D-核糖生产的影响，发现分阶段控制pH能获得较高的平均比生产速率以及生产强度；控制恒定pH值6.0，并且产物生产阶段控制溶氧30％时D-核糖产量和得率最高，分别为71.7gL-1和0.503molmol-1。
随后，在摇瓶中考察了基本培养基中芳香族氨基酸和维生素对枯草芽孢杆菌EC2生长以及D-核糖生产的影响。实验结果表明：L-酪氨酸、L-色氨酸、L苯丙氨酸、生物素、烟酸、吡哆醛的添加能改善菌体生长，提高D-核糖产量，特别是烟酸作用尤其明显。在单因素实验基础上，采用响应面分析方法对培养基中的维生素浓度进行了优化，确定最佳培养基组成，为深入研究D-核糖的代谢特性奠定基础。在此优化培养基中D-核糖质量浓度达到23.4gL-1，与预测结果一致，是不添加维生素时核糖产量的2.31倍。
为了减少副产物生产，研究了柠檬酸对枯草芽孢杆菌EC2发酵生产D-核糖的影响。在摇瓶和5L罐中分别添加不同浓度柠檬酸，结果表明0.2-0.5g L-1柠檬酸能改善D-核糖生产。在15L罐的放大实验中，未添加柠檬酸时D-核糖的产量及得率均接近5L罐生产水平，分别为70.9g L-1和0.497molmol-1。当添加0.3gL-1柠檬酸时，副产物浓度降低，D-核糖产量达到83.4gL-1，得率增加到0.587mol mol-1。添加柠檬酸后丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶活性降低，6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸酶活性增加。利用物料平衡和代谢反应的计量关系，分析了稳定期的代谢流分布，说明添加柠檬酸使磷酸戊糖途径和三羧酸循环流量增加，酵解途径和乙酸途径流量减少。
枯草芽孢杆菌EC2能同时利用乳酸和葡萄糖，并且乳酸消耗速率大于葡萄糖消耗速率。通过摇瓶实验和5L罐实验，考察了添加乳酸对D-核糖生产的影响。摇瓶实验结果表明添加3.0-7.0g L-1乳酸能增加D-核糖产量。5L罐实验证明添加6.0g L-1乳酸后，副产物乙酸和葡萄糖酸分别降低了90.4％和51.7％，D-核糖产量和得率分别增加到91.5gL-1和0.671mol mol-1。代谢流分析发现添加乳酸后，6-磷酸葡萄糖节点流量分布变化不明显，丙酮酸和6-磷酸葡萄糖酸节点流量分布发生明显变化，乙酸途径流量减少，三羧酸循环流量增加，6-磷酸葡萄糖酸生产葡萄糖酸的流量减少，形成5-磷酸核糖流量增加。此外，利用摇瓶实验比较了葡萄糖酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸、山梨酸、苹果酸和α-酮戊二酸等有机酸对D-核糖生产的影响。结果表明山梨酸、苹果酸、琥珀酸和乙酸明显抑制菌体生长，尤其是山梨酸；添加葡萄糖酸能促进D-核糖生产。