论文部分内容阅读
在豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv. viciae)的共生大质粒pRL1JI上已鉴定了13个结瘤基因,分属5个操纵子(nodO, nodMNT, nodFEL, nodD和nodABCIJ)。其中nodD是控制其它所有结瘤基因操纵子转录的重要调节基因,其产物NodD蛋白特异地结合于结瘤基因启动子并在植物分泌的诱导剂类黄酮存在时激活结瘤基因表达。nodD的表达受其产物的负反馈调控(negative autoregulation)。在研究NodD与结瘤基因启动子之间相互作用的过程中,本实验室发现了另一个新的蛋白因子(HurL)能够特异地结合结瘤基因启动子DNA并对其进行了分离纯化工作。体外实验结果表明,HurL蛋白在适当的浓度下,可刺激主要的结瘤调控基因nodD的体外转录,揭示其可能参与结瘤基因表达的调控。本文进一步确证了编码该蛋白的hurL基因为染色体基因,同时从豌豆根瘤菌染色体中克隆到hurL基因区域的3.1 kb大小的DNA片段并进行了测序。序列分析结果表明hurL基因编码的蛋白序列与细菌类组蛋白HU家族成员非常相似。引物延伸实验确定了hurL基因的转录起始位点在其起始密码子“ATP”上游31 bp的“C”。在hurL基因的终止密码子“TGA”下游约50 bp发现有一个回文结构,可作为转录的终止信号。因此hurL基因很可能作为一个独立的操纵子进行转录。对hurL启动子在豌豆根瘤菌体内转录表达的研究发现hurL基因在根瘤菌体内的表达并不稳定,随着根瘤菌的生长时间而上下波动。利用插入卡那霉素抗性基因和同源重组手段,本文构建了豌豆根瘤菌的hurL基因突变株。通过对hurL突变株在不同条件下生长和存活的研究,发现豌豆根瘤菌hurL基因的突变导致根瘤菌的生长严重不良和对紫外线敏感性的提高。证明hurL基<WP=3>因为根瘤菌维持正常生长所必需并有可能参与对受紫外线损伤DNA的修复过程。通过测定NodD蛋白产量和结瘤基因-lacZ报告基因转录水平,发现在hurL基因突变株中检测不到NodD蛋白并且nodD基因转录严重下降;nodA和nodF的表达变为即使在诱导剂存在时也不能够表达,而本实验室新近发现的px2基因的表达则有一定程度的上升。表明hurL基因是维持豌豆根瘤菌结瘤正常表达所必需的,它可能参与nodD基因转录的正调节并直接或间接地参与其它结瘤基因表达的控制。通过在Pisum sativum cv. Frisson(豌豆)和Vicia hirsuta(野豌豆)上的结瘤实验,发现豌豆根瘤菌hurL突变株不能够在这两种宿主植物上结瘤。而经野生型hurL基因互补的同一突变株在这两种植物上的结瘤数均恢复到野生型水平。说明hurL基因突变导致在宿主植物上的结瘤缺陷。虽然目前对hurL基因影响豌豆根瘤菌诱导植物结瘤能力的机制并不清楚,但本文的研究结果首次证明:除位于共生质粒上的结瘤(nod)基因和胞外多糖(exo)基因外,豌豆根瘤菌在宿主植物上的结瘤还受到染色体基因hurL的控制。