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哺乳动物生物反应器的研究已经取得了很大成就,目前,科学家已经建立牛、羊等生物反应器来生产外源蛋白。由于禽类特殊的生殖生理模式,造成禽类生物反应器的研究远远滞后,主要问题在于未能构建在禽类体内能有效调控外源基因表达的特异表达载体。其中上游载体的构建首要条件,实现外源基因在鹌鹑输卵管组织中的特异性表达必须有组织特性型的启动子的参与。卵清蛋白是蛋清中含量最高的蛋白,它的5’调控成分具有组织特异性,并受到激素的诱导,被几乎所有的研究者所利用。是为解决以上问题,发挥禽类作为生物反应器的优势,促进禽类生物技术的快速发展,本实验以鹌鹑作为研究对象,从以下几个方面进行研究:1鹌鹑卵清蛋白5’侧序列的克隆采用PCR技术成功地扩增、克隆了含鹌鹑卵清蛋白5’调控区的三个不同的序列OV1、OV2、ERE,序列(OV1)为鹌鹑卵清蛋白5’调控区上游序列长约1.1kb的片段;序列(OV2)为包含上游调控区以及第一内含子、第一外显子、第二外显子转录起始部分序列,长2.8kb左右;序列ERE为鹌鹑卵清蛋白调控区的雌激素反应元件,长675bp。2鹌鹑5’调控区启动GFP基因表达载体的构建使用以上三个序列与真核荧光表达载体pGFP-N2构建了三个表达载体pGFP-OV1、pGFP-OV2、pGFP-OV-ERE,即以鹌鹑卵清蛋白5’调控区作为启动子,替换荧光表达载体pGFP-N2上原有的CMV IE启动子,来启动GFP基因的表达。其中pGFP-OV1为OV1作为启动子、pGFP-OV2为OV2作为启动子、pGFP-OV-ERE是在pGFP-OV2的基础上,将雌激素反应元件(ERE)插入到OV2上SDRE位点上构建而成。3三种表达载体在鹌鹑原代输卵管上皮细胞和鹌鹑胚胎成纤维细胞上的表达为了检测三种载体的有效性,我们培养了鹌鹑自身的两种细胞:鹌鹑输卵管上皮细胞和鹌鹑胚胎成纤维细胞作为检测平台,将重组后的载体转染以上两种细胞,结果表明三种载体在成纤维细胞上均未表达;构建的三个表达载体在鹌鹑原代输卵管上皮细胞上均有表达但表达效果不同,在载体转染后48h时,三种载体的GFP阳性细胞表达数目都达到最高,pGFP-OV-ERE的GFP阳性细胞表达数目大于pGFP-OV2且差异显著(p＜0.05),pGFP-OV2大于pGFP-OVl且差异极显著(p＜0.01),pGFP-OV1、pGFP-OV2和pGFP-OV-ERE的GFP阳性细胞表达数目均小于对照组pGFP-N2且差异极显著(p＜0.01)。