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土壤盐渍化严重影响植物的生长和发育,制约着当今农业生产的发展,提高作物的耐盐性已成为一个日益紧迫的研究课题。随着分子生物学的深入研究,发现液泡膜Na+/H+离子逆向转运蛋白将Na+区隔化在液泡,是植物抵御盐胁迫的主要方式之一,在植物耐盐方面起着非常重要的作用。目前国内外已有利用液泡膜Na+/H+离子逆向转运蛋白基因转化农作物,并获得的耐盐能力相对提高的转基因植株的文献报道。本研究利用基因工程手段将HvNHY1基因导入宁夏重要的经济作物枸杞中,提高枸杞耐盐能力,为提高枸杞产量、盐碱的改良和扩大利用提供了很好的途径。
以枸杞叶片为外植体,优化出一套完整、高效的枸杞叶片再生体系。最佳的愈伤组织、不定芽诱导培养基为MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L;最佳的分化培养基为MS+6-BA0.3mg/L+IAA0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L;最佳的生根培养基为1/2MS+IBA0.6 mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7g/L;
利用电击法,将重组质粒pSMNHX导入到根癌农杆菌LBA4404中,成功获得工程菌LBA4404-pSM-NHX。利用农杆菌介导法将HvNHX1基因导入到宁夏枸杞中,对转化体系进行优化,确定了最终的转化条件:抑菌剂替卡西林的较适浓度为200-300mg/L,卡那霉素较适浓度为50mg/L。农杆菌侵染浓度在OD0.4-0.6之间、侵染6min、共培养3d的转化效果最好。
对侵染叶片进行再生培养,最终筛选出24株卡那霉素抗性枸杞,对其进行PCR检测,有9株显示阳性,转化率为38%。后对长势健康的6株阳性苗进行RT-PCR检测,结果表明HvNHX1已经成功整合到枸杞基因组中,并在RNA水平上得到表达。
对转基因和非转基因植株进行NaCl胁迫试验,用NaCl(0%、0.7%、1.2%、1.5%)溶液浇灌10d后测定转基因枸杞和非转基因枸杞的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、叶片Na原子含量等生理指标的变化,结果表明:盐胁迫处理后,转基因植株的SOD、POD活性均比对照高,且同一转基因植株在不同盐浓度下SOD、POD活性变化幅度较对照小,说明转基因植株对盐胁迫的耐受能力较强,受到的活性氧伤害较小。同浓度下,转基因植株的MDA含量要比非转基因植株少,表明转基因植株的受到的膜脂过氧化作用较弱,因此产生了比对照少的MDA。叶片Na原子含量测定结果表明:盐胁迫下转基因植株的Na原子含量随着盐浓度的增大而增加,非转基因枸杞的Na原子含量变化不大,说明由于外源基因的导入,使多余的Na+被区隔化在液泡中,从而减轻了盐离子对植株的伤害,一定程度上提高了植株的耐盐能力。
综合分析得出:在盐胁迫下,转基因枸杞表现出较好的耐盐特性,初步证明HvNHX1基因的导入对枸杞的耐盐性有所提高。