论文部分内容阅读
研究目的:急性髓细胞白血病(AML,Acute myeloid leukemia)是急性白血病中最常见的一种疾病类型,发病率随着年龄的增加而增加。虽然有些患者对于化疗很敏感,但是由于AML高度异质性以及老年患者合并症的存在导致多数患者长期生存偏差。AML患者难治/复发的根源在于患者体内存在白血病干细胞或者微小残留病灶,控制甚至治愈AML的途径应该是清除患者体内白血病干细胞。因此,临床迫切期望高效低毒副作用的新药出现,为临床医师的临床用药选择提供更多的帮助。CD47,也称为整合素相关蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,分子量大小约为50kDa,是广泛表达于各种细胞膜表面的跨膜蛋白。CD47可以与信号调节蛋白α(SIRPα,signal regulatory proteinα)、血小板反应蛋白1(TSP-1,thrombospondin-1)、TSP-2结合介导许多细胞功能,包括白细胞黏附和迁移、T细胞活化、凋亡和吞噬等。其中CD47与SIRPα结合介导的抑制吞噬细胞吞噬活性尤为重要。CD47免疫检查点抑制剂(CD47靶点单克隆抗体)可以阻断CD47与SIRPα的结合,抑制性信号被解除,可以重新激活吞噬细胞功能,吞噬消除恶性或死亡细胞。既往研究已经初步证实,在多种肿瘤中,CD47靶点单克隆抗体或者SIRPα靶点单克隆抗体均可以发挥很好地抗肿瘤效应。众多研究发现CD47普遍高表达于各种恶性肿瘤细胞,但是很少有研究探究何种分子机制导致CD47异常高表达。本研究旨在探讨国产CD47靶点单克隆抗体体内外抗AML效应,并初步探讨导致CD47异常高表达的分子生物学机制,为改善AML治疗效果提供参考依据。研究方法:利用流式法检测21例临床确诊为AML患者和多种AML细胞系CD47表达水平。提取小鼠骨髓来源单核细胞和人外周血来源单核细胞经体外定向诱导分化为巨噬细胞。利用免疫荧光法和流式法检测国产CD47单抗增强巨噬细胞体外吞噬效应的现象,利用Annexin V/PI法检测国产CD47单抗对于AML细胞凋亡的影响,利用流式法检测国产CD47单抗对于AML细胞增殖的影响。选用NOG重度免疫缺陷小鼠作为荷瘤小鼠,指数期增长的U937经尾静脉注射构建AML模型,腹腔注射用药探究体内抗AML效应。通过Western blot和PCR方法,初步探究导致AML细胞高表达CD47的机制。研究结果:与正常骨髓细胞相比较,AML患者和细胞系普遍高表达CD47。本研究随机选取的21例患者中,所有患者的CD47表达量均高于正常对照组,其中17例CD47的表达量高于正常组的2倍。健康对照组MFI为628.3(范围为446-884),AML组MFI为3430.6(范围为952-9310)。与IgG4相比,国产CD47单抗处理细胞后,0H、24H、48H和72H细胞增殖数并没有降低,Annexin V/PI法检测细胞凋亡率也并没有增多。流式法发现3种国产CD47单克隆抗体均可以很好地结合AML细胞,进一步研究发现国产CD47单克隆抗体可以竞争性拮抗原研CD47单克隆抗体的结合位点,为未来临床药物的推广应用提供了良好的理论基础。体外实验发现:对于高表达CD47的细胞系,国产CD47单抗可以增强巨噬细胞对此类细胞的吞噬清除,而对于低表达CD47的细胞系则无此效应。国产CD47单抗可以促进巨噬细胞对于原代AML细胞的吞噬消除。体内实验同样可以发现国产CD47单抗可以显著延长小鼠生存期。通过Western blot和PCR法,我们初步探讨了一下导致AML细胞表面高表达CD47的可能机制,令人欣喜的是,我们发现缺氧诱导因子1与CD47的过表达存在明显的相关性。研究结论:国产CD47靶点单克隆抗体可以通过阻断CD47/SIRPα信号通路重新激活巨噬细胞功能,增强巨噬细胞对AML细胞的吞噬清除。另外本研究初步发现缺氧诱导因子可以调控CD47的表达。