中华绒螯蟹肌肉生长发育关键基因(MSTN)的分子功能与育种功能初步研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liangzhenghai
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肌肉的生长发育与中华绒螯蟹的蜕壳和躯体增长存在紧密联系。本文对中华绒螯蟹不同蜕壳阶段(蜕壳前期D、蜕壳期E、蜕壳后期A和蜕壳间期C)的肌肉进行组织学观察,以及蜕壳前后(D、A)肌肉进行了比较转录组学分析的基础上,筛选出了肌肉发育的正、负调控候选基因和关键调控基因(MSTN)。然后采用RNAi技术对此关键基因(MSTN)进行初步的分子功能研究。同时,通过大样本检测了MSTN基因的单核苷酸多态性(SNP)和生长性状的相关性,探讨了该基因作为分子育种功能的可行性。论文的具体研究结果如下:一、中华绒螯蟹步足肌肉生长发育的关键基因发掘为探讨中华绒螯蟹蜕壳前后肌肉组织的表观变化和基因表达差异,挖掘肌肉生长发育的关键基因,本章实施了四个具体蜕壳时期(蜕壳前期D3-4、蜕壳期E、蜕壳后期A2d和蜕壳间期C10d)的步足肌肉的组织学观察和含水量测定,以及蜕壳前期(D)和蜕壳后期(A)的肌肉转录组分析。结果发现:蜕壳前期的肌纤维直径和横截面积最大,蜕壳后期最小,其大小顺序均为D>E>C>A,相互间存在极显著差异(P<0.01);而肌纤维密度却是与以上顺序完全相反,表现为蜕壳后期最大,蜕壳前期最小。蜕壳后期(A6h)的含水量最高(86.37%),蜕壳前期(D3-4)的含水量最低(74.49%),差异极显著(P<0.01)。转录组分析发现蜕壳前期的高表达基因1387个,主要富集在蛋白质水解、肌管切割等肌肉发育负调控过程;而蜕壳后期的高表达基因877个,主要富集在肌细胞增殖,成肌细胞融合等大量细胞增殖过程。同时还筛选得到了肌肉发育负调控基因4个(POMT,NEB2,ZCI2A and MSTN)和肌肉发育正调控基因4个(TITIN,mTOR,XRCC and ICCR),并重点对MSTN基因的时空表达差异进行了分析,发现MSTN基因在蜕壳后期(A6h)的表达量最高,蜕壳前早期(D0)的表达量最低。该章研究结果为了解河蟹蜕壳前后的肌肉结构变化和分子基础奠定了基础。二、中华绒螯蟹肌肉生长发育关键基因(MSTN)的分子功能初步研究为进一步探讨MSTN基因对中华绒螯蟹蜕壳、生长的分子生物学功能,本章采用RNAi技术完成了3个蜕壳周期的连续干扰实验。结果发现:针对MSTN设计的dsRNA干扰效率较高,特别是在注射后48h的干扰效率最高(敲降效率为99%)。进一步实验发现:第一个蜕壳周期干扰结束后,干扰组比对照组的蜕壳速度有所加快,但差异不显著(P>0.05),而增重率却显著低于对照组(P<0.05);第二、三个周期干扰结束后,干扰组的蜕壳时长、增重率显著低于对照组(P<0.05)。综合三次干扰结果发现,中华绒螯蟹MSTN基因被干扰后,蜕壳速率显著加快,蜕壳周期显著缩短,但蜕壳后的增重率较低。综合研究表明,沉默MSTN基因可以显著加快中华绒螯蟹的蜕壳,在养殖过程中可以进行人工干预加快蜕壳。三、中华绒螯蟹肌肉生长发育关键基因(MSTN)的育种功能初步研究本章选取肌肉发育负调控基因(MSTN)对其进行初步的分子结构和生长性状相关性进行研究,利用PCR直接测序对MSTN基因进行分型,探讨不同基因型与生长性状(体重、壳长)的相关性,分析该基因作为分子育种功能的可行性与潜力。研究结果表明:该基因的第1外显子存在3个多态性SNP位点(S1:C714T;S2:G729A;S3:G753T),均为处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)的中、高度多态性位点。利用一般线性模型分析3个位点及其基因型组合与生长性状的相关性,结果发现S1位点对中华绒螯蟹的体重和壳长等生长性状有显著影响(P<0.05),而其余两个位点与生长性状无显著关联性。综合研究表明,S1位点的TT基因型对中华绒螯蟹的生长最为有利,可作为分子标记辅助育种的候选标记,具有分子育种功能的潜力。
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