产赖氨酸大肠杆菌的适应性进化及机制解析

• 作 者: 王晓玮
• 出 处: 天津科技大学
• 发表日期: 2019年01期
• 关键词: 赖氨酸 耐受性 适应性进化 发酵终点液

赖氨酸是必需氨基酸的一种,广泛用于饲料、食品添加剂,化工工业等,2017年全球产量达到277万吨。其工业生产以微生物发酵为主,目前文献报道大肠杆菌发酵生产赖氨酸已经超过136 g/L。工业生产上使用的生产菌株多是经过诱变育种或针对已知途径或辅因子进行大量代谢工程改造的工程菌株,而进一步的理性设计需要新的改造靶点。另外高产菌株在发酵后期必然面临高浓度产物、多种未知副产物的复杂压力环境,往往无法维持高产酸活力,这是限制赖氨酸产量提高的重要因素。由于耐受环境的复杂性和缺少改造靶点,采用非理性的进化和筛选是进一步提升菌株产酸性能的理想方法。目前虽有利用适应性进化提高菌株对某单一胁迫压力的耐受性,然而由于其不能很好地再现实际生产中的复杂压力环境,在工业生产应用时可能无法达到预期效果。针对以上问题,本研究开展了如下工作:(1)改进了 GREACE技术,通过替换诱导型启动子使DnaQ表达可控,通过使用温敏型复制原点确保质粒可以快速丢失,从而改善了进化菌株的遗传稳定性问题。(2)以实际发酵终点液添加不同浓度赖氨酸来模拟发酵过程中的真实复杂压力,结合GREACE技术提高菌株突变率,对赖氨酸高产大肠杆菌出发菌株MU-11进行适应性进化,富集筛选获得六株在孔板水平上表现出耐受性与产量均提升的突变菌株。进一步在5 L发酵罐中对突变菌进行发酵能力测试,结果发现RS3突变菌株的赖氨酸产量为155 g/L,较出发菌提高14.8%,转化率提高9.2个百分点,PI染色显示细胞膜未受损的细胞比例提高了 40%。通过代谢物组分析发现,突变菌株的代谢流向更有利于赖氨酸的合成。(3)对出发菌株MU-11和突变菌株RS3进行全基因组测序及比较基因组分析,发现基因speB、atpB、secY存在点突变。过表达speB、atpB突变基因,弱化secY基因表达的重组菌株在摇瓶发酵体系中,其赖氨酸产量比对照菌株提高12.2%-14.4%。本工作为理性设计赖氨酸菌株提供了新的改造靶点;本工作建立的在模拟真实环境的复杂胁迫压力下进行适应性进化的方法可能对提升其它菌株的耐受性状具有借鉴作用。