马铃薯黑痣病生防芽胞杆菌筛选及作用机理初探

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马铃薯黑痣病是生产上一种重要的土传真菌病害,当前主要依靠沟施嘧菌酯等化学药剂进行防控。而化学药剂在杀死病原菌同时也会抑制或杀死土壤中的有益微生物,从而影响马铃薯产业的可持续发展。芽胞杆菌是一类行之有效的植物病害生防菌,本研究通过对马铃薯黑痣病生防芽胞杆菌的筛选、发酵条件的优化、盆栽防效和促生作用及作用机理的初步研究,为马铃薯黑痣病的生物防治及优良生防菌剂的开发奠定基础。主要研究结果如下:  1.通过土壤稀释法,共分离到142株芽胞杆菌。经抑菌圈法和平板对峙法共得到6株对马铃薯黑痣病菌具有较强抑制效果的芽胞杆菌,其抑菌圈直径达28.5mm以上且抑菌带宽度大于6.0mm。研究了温度对所筛选到的菌株抑菌效果的影响,结果表明抑菌效果随温度下降而减小,温度为15℃时,菌株HN-Q-8抑菌效果显著高于其他菌株,温度为10℃时,所得菌株均无抑菌作用,表明生防菌的有效抑菌温度大于10℃。通过形态学观察以及gyrB序列系统发育分析将筛选得到的6个芽胞杆菌鉴定为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。  2.采用平板计数法和比浊法对贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8的培养条件进行测定,结果表明,种子液的最佳培养时间为20h;菌株HN-Q-8的最佳培养基为葡萄糖3.0%,酵母膏0.5%,NaCl0.3%,MgSO40.1%;最佳培养条件为:温度32℃,初始pH6.0,转速200rpm,接种量2%,摇瓶最佳装液量为40mL/250mL。  3.盆栽试验测定了菌株HN-Q-8对马铃薯黑痣病的防治效果和对马铃薯苗促生作用,结果表明HN-Q-8发酵液浸种和灌根处理均能够有效防治马铃薯黑痣病,防效分别为52.72%和61.22%;能促进马铃薯植株的生长,尤其是马铃薯根系,鲜重增长率高达77.45%,根长增长率为23.27%,说明HN-Q-8能促使马铃薯根系生长。  4.研究了HN-Q-8对马铃薯相关防御酶活性的影响,将HN-Q-8发酵液施入马铃薯根际后显著提高了马铃薯叶片内SOD、POD和CAT活性,说明HN-Q-8能诱导马铃薯产生防卫反应。HN-Q-8预处理后挑战接种病原菌明显提高了POD活性,说明HN-Q-8能在一定程度上诱导马铃薯产生抗病性。  5.采用绿色荧光蛋白(GFP)基因和氯霉素(Cm)抗性基因对贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8进行标记,研究其在马铃薯根际的定殖规律。结果表明GFP基因和Cm基因均能在HN-Q-8中很好的表达,室内抑菌带宽度为7.4mm;生长曲线与野生菌株大体一致,说明质粒对HN-Q-8的生长无明显不利的影响;质粒稳定试验表明经培养120h后,质粒稳定性为58%,说明质粒能够在HN-Q-8中稳定遗传。将该菌株的发酵液施入马铃薯根际土壤中,土壤中菌含量急剧增长,7d后达到最大值,为2.83×104cfu/g,之后逐渐下降,28d后菌含量趋于稳定,接种后38d检测到根际土壤中定殖量为5.33×103cfu/g,而马铃薯植株内未检测到标记菌株。说明该菌株可以稳定定殖于马铃薯根际土壤中,但不能定殖于马铃薯植株内。
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