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研究背景:阿尔茨海默病俗称老年痴呆,以认知功能的逐渐恶化为主要临床表现,病理特征主要为神经元数量减少、老年斑以及神经原纤维缠结等。其中老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白,β淀粉样蛋白可以引起胞内信号通路的异常激活,破坏原有的离子稳态,造成线粒体功能紊乱、活性氧升高、脂质过氧化等多种细胞损伤,加速细胞凋亡。而β淀粉样蛋白的产生也与衰老密切相关,D-半乳糖脑老化模型是国内外研究衰老比较常用的一个模型,短期内在动物体内大量注射D-半乳糖可以造成机体组织中的D-半乳糖过剩,引起能量代谢障碍,导致免疫功能低下、引起动物体内β淀粉样蛋白含量的增加和脑源性神经营养因子BDNF的表达下调,产生类似于老年痴呆的学习记忆障碍,延缓衰老、减轻β淀粉样蛋白的产生、沉积及毒性是药物研究的热点问题。远志属于传统的益智类中药,具有交通心肾、安神益智和祛痰开窍的功效,近年来,寡糖酯类成分逐渐引起药物学家的关注。现代药理研究表明,寡糖酯类成分具有抗氧化、抗炎、抗抑郁和神经保护等多种药理作用,本课题组前期研究证明,远志寡糖酯可以显著改善东莨菪碱诱导的小鼠认知障碍和增强APP/PS1双转基因小鼠海马突触可塑性的作用,提示其可能具有抗AD的潜力。基于上述研究背景,本研究选用Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤及D-半乳糖诱导的快速衰老痴呆模型,进一步研究远志寡糖酯的抗痴呆和神经保护作用。第一部分远志寡糖酯抗Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用及相关机制研究目的:采用Aβ25-35体外损伤SH-SY5Y细胞为实验模型,探讨远志寡糖酯的神经细胞保护作用及相关机制。方法:体外常规培养SH-SY5Y细胞株,预先分别使用50μg·mL-1、100 μg·mL-1、200μg·mL-1和400μg·mL-1的远志寡糖酯处理2h,然后给与25μmol·L-1的Aβ25-35进行损伤。MTT法检测细胞活性;生化法测定细胞胞内超氧化物脱氢酶活性、培养上清中乳酸脱氢酶水平和丙二醛含量;ANNEXINV-FITC/PI染色,细胞流式法检测细胞的凋亡率;Western Blot检测胞内蛋白Bcl-2、Bax、p-CREB/CREB、p-AKT/AKT和BDNF的表达情况。结果:远志寡糖酯能够显著提高Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞的存活率,减少细胞LDH释放,增加胞内SOD活性并降低MDA含量,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低凋亡蛋白Bax的表达,降低细胞凋亡率,且能够上调脑源性神经营养因子BDNF、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白CREB和蛋白激酶B AKT的磷酸化水平。结论:远志寡糖酯能够显著减轻Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞损伤的作用,可能与抗氧化、增强AKT-CREB-BDNF信号通路和抗细胞凋亡有关。第二部分:远志寡糖酯对D-半乳糖诱导的脑老化痴呆小鼠的学习记忆的改善作用及相关机制目的:观察远志寡糖酯对D-半乳糖诱导的快速脑老化痴呆小鼠的学习记忆的改善作用及相关机制方法:8周龄雄性昆明小鼠72只,随机均分为正常对照组、D-半乳糖组、盐酸多奈哌齐组(1.67mg·kg-1·d-1)和远志寡糖酯低(28.67 mg·kg-1·d-1)、中(57.33 mg·kg-1.d-1)、高(114.66mg·kg-1·d-1)剂量给药组,各组小鼠腹腔注射D-半乳糖120mg·kg-1·d-1,同时灌胃给予相应药物60d,正常对照组小鼠给与等量溶媒。为检测远志寡糖酯对D-半乳糖脑老化小鼠学习记忆的改善作用及相关机制,造模和给药结束后,旷场实验检测小鼠的自主行为变化;跳台实验和水迷宫实验检测小鼠的学习记忆情况;取小鼠血清,生化法检测血清中超氧化物歧化酶的活性和丙二醛的含量;4%多聚甲醛灌注取脑,免疫组织化学检测小鼠脑中BDNF和β淀粉样蛋白的表达情况;Western Blot检测小鼠大脑皮层中p-CREB/CREB、p-AKT/AKT和BDNF的含量变化。结果:旷场实验结果显示,正常对照组小鼠、D-半乳糖组小鼠、盐酸多奈哌齐组小鼠和远志寡糖酯各给药组小鼠的自主行为均无显著变化。Morris水迷宫实验结果显示,随着训练时间的延长,远志寡糖酯57.33 mg·kg-1·d-1给药组能够显著缩短D-半乳糖脑老化小鼠找到平台的潜伏期,在探索试验中减少首次穿台潜伏期,并增加小鼠的穿越平台次数,盐酸多奈哌齐以及远志寡糖酯28.67 mg·kg-1·d-11给药和114.66 mg·kg-1·d-1给药对D-半乳糖脑老化小鼠的首次穿台潜伏期以及穿越平台次数无显著影响;跳台实验结果显示,盐酸多奈哌齐和远志寡糖酯57.33 mg·kg-1·d-1给药和114.66 mg·kg-1·d-1给药能够能够显著减少D-半乳糖脑老化小鼠的错误跳台次数,远志寡糖酯57.33 mg·kg-1·d-1给药还能够显著缩短D-半乳糖脑老化小鼠的首次跳台潜伏期;生化测定结果显示,盐酸多奈哌齐对D-半乳糖脑老化小鼠血清中SOD活性无显著影响,但能够显著降低MDA含量,远志寡糖酯各剂量给药既能够显著增强D-半乳糖诱导脑老化小鼠血清中SOD的活性,也可以显著降低MDA含量;免疫组织化学结果显示,盐酸多奈哌齐和远志寡糖酯57.33 mg·kg-1·d-1给药能够显著提高小鼠大脑皮层中BDNF的表达水平;但各组间小鼠大脑皮层中的beta淀粉样蛋白的含量均无显著性差异。Westem Blot结果显示,远志寡糖酯可以显著提高D-半乳糖脑老化小鼠大脑皮层中BDNF的表达以及CREB和AKT的磷酸化水平。结论:远志寡糖酯能够显著改善D-半乳糖脑老化小鼠的学习记忆能力,减轻氧化损伤,可能与调节AKT-CREB的磷酸化水平,从而提高下游产物BDNF表达有关。