豆科作物高效器官再生体系的建立及其在遗传转化中的应用

• 作 者: 单志慧
• 机 构: 南京农业大学
• 出 处: 南京农业大学
• 发表日期: 2005年期

豆科作物在人类经济生活和生态环境中具有重要的作用。遗传转化为新种质的创建和功能基因组的研究提供了新的工具。豆科作物的遗传转化受其再生顽拗性的限制，现有的再生体系多存在再生效率低且基因型依赖性强等不足。开发高效的再生体系有利于推动遗传转化以及相关研究的进程。　　
本研究以豌豆品种“Espace”为材料，将豌豆种子直接置于含有苯基噻二唑基脲（TDZ）的培养基上进行丛生芽诱导，器官再生频率高达100％。每粒种子产生的丛生枝数量取决于TDZ的浓度和TDZ培养时间。在TDZ为4mg/L的培养基上培养12周后，每粒种子产生的丛生枝数量可达到200多个。高浓度生长素可以克服TDZ对生根的抑制作用，使生根效率达到90％以上。在TDZ培养基上，当豌豆幼苗连续培养4周以上时，茎节处的腋芽分生组织形成丛生芽组织，在TDZ培养基上的继代培养能长久维持其再生潜能。在丛生枝伸长培养基上连续培养16周后，每克鲜重丛生芽组织产生的丛生枝数量可达700多个。将该体系应用于其它7个基因型时，丛生枝状植株和丛生芽组织形成的效率仍然很高，根据外植体在TDZ培养基上的生长形态很容易地确定形成丛生芽组织所需的最佳TDZ浓度。　　
为了建立稳定、可靠的转化体系，我们利用携带荧光素酶报告基因的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AGLO侵染萌发的“Espace”种子及其丛生芽组织。结果表明：外植体的类型以及共培养的有无对农杆菌的转化效率没有显著的影响。将丛生芽组织继代培养的特性和荧光素酶基因的指示作用相结合能够有效地除去非转化组织，纯化的转基因组织系产生转基因植株的效率可达到88％，大多数植株能够产生具有荧光素酶活性的T1和T2代种子。Southern检测表明外源基因已整合入豌豆基因组。　　
为了探索继代培养体系在其他物种中应用的可行性，我们以大豆为对象进行了实验。将大豆品种“白脐”的种子置于TDZ培养基上直接萌发，1周后分离子叶节并转入含有苄基腺嘌呤（BA）的培养基中，经6-8周培养后在子叶节处形成丛生芽组织。我们注意到：只有含有腋芽的子叶节才能形成丛生芽组织。通过在MS0.1T培养基上的继代培养，丛生芽组织可通过自身存在的分生细胞繁殖长期维持其再生能力。在含有0.5mg/L苄基腺嘌呤的伸长培养基上培养4周后，每克鲜重丛生芽组织可产生的丛生枝多达336个。丛生枝的生根率达90％以上，再生植株移入温室后全部成活并表现为可育。在其他4个基因型上应用该系统也获得了大量的丛生芽组织，表明该体系没有明显的基因型依赖性。　　
根据TDZ在豌豆和大豆器官再生中的作用规律，对花生、菜豆和油菜进行了相似的试验并建立了相似的丛生芽继代培养体系。结果表明：在豆科作物中，外植体中腋芽分生组织的存在对丛生芽组织的形成是非常必要的。但每个作物形成丛生芽组织所需的最佳TDZ浓度显著不同，根据外植体在TDZ培养基上的形态反应很容易确定形成丛生芽组织所需要的最佳浓度。由丛生芽组织发育而来的丛生枝均可生根并形成可育植株。因此，以腋芽分生组织的繁殖为基础的丛生芽组织继代培养体系可以被推广至更广泛的基因型和更多的作物当中。