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APOBEC3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like3G,载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G,简称为A3G)是2002年Sheehy发现的天然抗病毒限制因子,代表近年来病毒研究领域的一项重大进展,不仅拓展了对病毒宿主相互作用的认识,也为研发抗病毒药提供了新的思路和方向。不过,A3G的结构、功能和抗病毒机制仍有许多未解的重大问题,进一步深入和系统的研究,可能为预防和治疗HIV/AIDS及多种病毒性疾病,提供新的线索。
本研究的最初线索,来源于前期工作中的偶然发现:我们试图在一个健康个体PBMC中克隆A3G编码序列,经双向测序后发现,有5个位点属非同义突变,造成氨基酸序列的改变。为排除个体差异并出于研究的便利,我们采用单核样细胞系THP-1,进行多条序列的克隆和分析。在研究中,我们使用错误率仅为1.6×10-6的高保真酶Pfu,共克隆到23条A3G基因编码序列。经双向测序和对比分析,较为意外地发现,其中20条序列具有2个以上的非同义突变或截断错位,突变率高达87％,显示A3G基因在THP-1细胞中存在多重正常或变异的转录本。这一现象,是否代表天然突变的普遍性以及其频度和意义,有待于进一步在多种细胞和人群多个个体中验证和大规模的系统研究。
为建立基本的实验体系和研究手段,我们通过RT-PCR与Western blotting,检测了A3G基因在9个细胞系内的本底表达水平,并在此筛选结果的基础上,在低本底的细胞系中,以慢病毒系统表达A3G基因,而在高本底细胞系中,通过siRNA沉默A3G基因,建立了A3G高低表达体系,为后续研究A3G功能提供了方便可行的实验平台。
我们选取野生型A3G、带有3个位点(H186R、I309T、F310S)连锁的突变体和5个位点(W34R、Y222H、V224G、A246V、F289L)非连锁的突变体,构建真核表达载体,转染HEK293T细胞,对比观察不同转录本在细胞中的表达动态和水平。结果发现,3个位点的突变对A3G蛋白细胞内定位无明显影响,5个位点的突变明显增加了单个细胞中A3G蛋白点灶状团块的比例。并且突变位点明显减缓了A3G的表达速率,降低了表达水平。而连锁、非连锁以及截断错位的突变体在抗病毒功能和结构生物学上的意义,有待于进一步的深入分析。
综上,我们发现A3G在THP-1细胞中存在多重转录本,并在确定细胞系A3G本底表达的基础上,建立了A3G体外高低表达体系,为后续我们进一步研究A3G的功能奠定了基础。而部分突变体在细胞内的表达趋势和细胞内定位的观察和分析,为进一步的深入研究提供了新的线索。