海洋防污活性菌株天然产物的分离纯化及其发酵优化

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海洋生物污损对海中人工设施造成严重危害,传统重金属防污剂如有机锡和氧化亚铜等因其毒性相继被禁用或限用,急需开发新型环保防污剂,其中海洋生物体内的防污损活性物质是重要来源。但海洋动植物中的防污损活性物质通常含量低,严重限制其开发利用。微生物可通过发酵进行规模化培养,有利于解决天然防污损产物在量上的难题。另外,海洋生物的体表微生物在防御体表污损中起到重要作用。对海洋生物体表微生物进行鉴定和防污损活性物质研究,不仅为揭示海洋微生物与海洋污损生物之间的化学生态关系和相互作用提供新的研究资料,还将有助于促进新型环保海洋防污损技术的研发。本文对海洋生物体表微生物菌株进行研究,筛选具有防污损活性的菌株,对其次级代谢产物进行分离纯化,得到具有防污损活性的单体化合物,并根据活性化合物的产量进行培养基优化,主要结果如下。  (1)对分离自海绵和海鞘等海洋生物体表的25株菌进行了菌种鉴定,其中弧菌属(vibrio)4株,杆菌属(bacillus)2株,链霉菌属(Streptomyces sp.)17株,稀有放线菌拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis alba)2株。并检测了微生物发酵液的乙酸乙酯提取物对沙筛贝(Mytilopsis sallei)和白脊藤壶(Balanus albicostatus)附着的抑制作用,共有7株菌具有较好的防污损活性,菌株S-1、P-3、P-5、P-9、P-18、P-19抑制沙筛贝附着的EC50分别为:14.94、8.93、37.51、22.36、34.35、18.73μg/ml;菌株P-3、U-25对抑制白脊藤壶幼体附着的EC50分别为9.41和8.23μg/ml。  (2)以发酵产物得率和防污损效果为指标,对防污损活性较好的菌株U-25进行了发酵条件和提取方法的探索,确定发酵最佳时间为4d,配制2216E培养基时天然海水优于人工海水,发酵液以等体积的乙酸乙酯进行萃取优于大孔树脂法提取。  (3)从细菌U-25次级代谢产物中分离纯化得到6个化合物,结构鉴定为酪醇、2-Hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-ethanone、吲哚-3-乙醛酸、环酪氨酸-脯氨酸、对羟基-苯甲醇、吲哚-3-甲酸;检测出酪醇、2-Hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-ethanone、吲哚-3-乙醛酸、环酪氨酸-脯氨酸对多室草苔虫(Bugula neritina)幼体具有抑制附着作用,EC50分别是102.18、34.82、29.32、27.17μg/ml。  (4)以化合物2-Hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-ethanone的产量为指标,利用正交实验和两因素实验对细菌U-25进行2216E培养基优化,发现蛋白胨对化合物产量影响最显著,获得了培养基最优配方,将化合物的产量从180.01μg/L提高到1359.71μg/L,提高了7倍。
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