论文部分内容阅读
目的:本实验以新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic braindamage,HIBD)模型为研究对象,通过测定HIBD后不同时间点海马CA1区神经元凋亡率及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和脑红蛋白(Ngb)的表达,探讨三者在HIBD后表达的变化规律及其相关性,进一步阐明凋亡与HIBD之间的关系以及Ngb在HIBD中发挥保护作用的机制,从而为今后新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)的治疗,特别是迟发性脑损伤的治疗开辟新的途径。
方法:选用60只新生7日龄Wistar大鼠,随机分为以下三组:sham组(n=6):行颈部手术,只暴露左侧颈总动脉,不结扎,也不进行缺氧处理,手术结束时处死动物取材。正常对照组(n=6):正常大鼠,不做任何处理,与sham组同时间处死动物取材。HIBD组(n=48):分离并结扎左侧颈总动脉,术后恢复2h,进入8％O2与92％N2混合气体环境中缺氧2h,之后放回母鼠身边喂养,不作其他处理,分别于HIBD后3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d、14d取材,每个时间点n=6,应用硫堇染色观察各组海马CA1区组织病理形态学变化,应用免疫组织化学染色方法检测各组海马CA1区Bcl-2、Bax及Ngb的表达变化情况,同时采用流式细胞技术检测各组大鼠海马神经元的凋亡率。
结果:
1海马CA1区组织病理形态学改变:sham组和正常对照组新生大鼠的海马CA1区锥体细胞排列整齐,细胞形态完整。HIBD组缺氧缺血后3h海马CA1区有少量神经细胞表现为细胞收缩变圆、细胞间失去联系、核固缩变圆、呈强嗜碱性、核仁消失、核染色质聚集在核膜下、呈环状;6h病变更广泛;12h、24h时核碎裂进一步增多,并见许多死亡细胞;48h死亡达高峰。HIBD组缺氧缺血后24h～14d,HG显著升高,ND显著下降,与sham组和正常对照组比较,存在显著差异(P＜0.05)。
2流式细胞仪检测海马CA1区神经元凋亡率:正常对照组与sham组新生大鼠海马神经元凋亡率无显著差异。与sham组相比,HIBD组新生大鼠于缺氧缺血后3h海马神经元凋亡率即开始升高,但差异无统计学意义;于缺氧缺血后12h凋亡率显著升高,48h时达高峰,72h时开始下降,7d时明显低于高峰水平,而与sham组无显著差异,14d时基本恢复至sham组水平。
3 Bcl-2蛋白表达变化:正常对照组和sham组新生大鼠海马CA1区有极少量Bcl-2阳性表达细胞。与sham组相比HIBD组于缺氧缺血3hBcl-2阳性表达细胞开始显著增多,于12h达到高峰,24h时开始逐渐下降,14d时略高于sham组表达,但差异无统计学意义。
4 Bax蛋白表达变化:正常对照组新生大鼠海马CA1区未见Bax蛋白的阳性表达。Sham组新生大鼠海马CA1区于术后有很少量Bax阳性表达的锥体神经元。与sham组相比,HIBD组Bax蛋白免疫反应阳性细胞数目于缺氧缺血后3h时开始增加,12h时明显增多,于48h达高峰,此后逐渐下降,7d时阳性细胞数基本恢复至sham组水平,14d时未见Bax蛋白的阳性表达。
5 Ngb蛋白表达变化:正常对照组和sham组中,在海马CA1区均可见一定数量的Ngb蛋白免疫反应阳性细胞,且数量无显著差异。与sham组相比,HIBD组Ngb蛋白阳性细胞数于缺氧缺血后3h开始下降,但差异无统计学意义;6h、12h、24h呈逐渐下降趋势,阳性细胞数量已明显低于sham组;到48h时达最低水平;此后逐渐上升,7d时与sham组相比差异无统计学意义;14d时Ngb蛋白阳性细胞数量基本恢复至sham组水平。
6海马神经元凋亡与Ngb蛋白表达的关系:新生大鼠缺氧缺血后海马CA1区内Ngn蛋白阳性细胞数与海马神经元凋亡率呈负相关(r=-0.783,P＜0.01),即在一定时间内(HIBD48h内)随Ngb蛋白阳性细胞逐渐减少,神经元凋亡率呈现上升趋势;在一定时间内(HIBD48h后)随Ngb蛋白阳性细胞的逐渐增加,神经元凋亡率呈现下降趋势。
7凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)表达与Ngb蛋白表达的关系:新生大鼠缺氧缺血后海马CA1区内Ngb蛋白阳性细胞数与凋亡相关蛋白Bcl-2阳性细胞数无相关(P＞0.05);新生大鼠缺氧缺血后海马CA1区内Ngb蛋白的阳性细胞数与凋亡相关蛋白Bax阳性细胞数呈负相关(r=-0.697,P＜0.01),即在一定时间内(HIBD48h内)随Ngb蛋白阳性细胞的逐渐减少,Bax蛋白阳性细胞逐渐增多;在一定时间内(HIBD48h后)随Ngb蛋白阳性细胞的逐渐增加,Bax蛋白阳性细胞随之逐渐减少。
结论:
1 Bcl-2与Bax基因参与了HIBD后神经细胞凋亡的发生,Bax可能是通过抑制Bcl-2的活性而使其促凋亡作用占优势,从而启动细胞凋亡程序,促使神经细胞发生凋亡。
2 HIBD后Ngb蛋白的表达呈时相性变化,与神经元的凋亡率呈负相关,提示Ngb在缺氧缺血脑损伤中具有神经保护因子的作用。
3 HIBD后Ngb蛋白的表达与Bax蛋白的表达呈负相关,提示Ngb可能通过抑制促凋亡蛋白Bax的表达,从而减少神经细胞的凋亡,发挥其神经保护作用。这为临床HIBD患儿的治疗提供了新的思路。