【摘 要】
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细粒棘球蚴病（chinococcosis）又称囊型包虫病（Hydatidosis）,是呈世界性分布的人畜共患寄生虫病。中国是囊性包虫病的主要流行国之一,该病不仅对我国畜牧业造成重大的经济损失,而且严重危害我国牧民的身体健康。动物包虫病的诊断是防控包虫病的关键技术。抗原B（AgB）是绦虫特有的热稳定脂蛋白,在细粒棘球绦虫的各个发育阶段均高表达,是很好的候选诊断抗原。细粒棘球蚴抗原B（Eg-AgB）可
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细粒棘球蚴病（chinococcosis）又称囊型包虫病（Hydatidosis）,是呈世界性分布的人畜共患寄生虫病。中国是囊性包虫病的主要流行国之一,该病不仅对我国畜牧业造成重大的经济损失,而且严重危害我国牧民的身体健康。动物包虫病的诊断是防控包虫病的关键技术。抗原B（AgB）是绦虫特有的热稳定脂蛋白,在细粒棘球绦虫的各个发育阶段均高表达,是很好的候选诊断抗原。细粒棘球蚴抗原B（Eg-AgB）可通过自我折叠形成低聚体,因最小低聚体为8k Da故被称为Eg-AgB8,目前已发现Eg-AgB的5个亚型分别为Eg-AgB8/1、Eg-AgB8/2、Eg-AgB8/3、Eg-AgB8/4和Eg-AgB8/5（Eg-AgB8/1-5）。本研究比较了AgB8/1、AgB8/2、AgB8/3和AgB8/5作为诊断抗原的敏感性和特异性以及AgB8/1、AgB8/2和AgB8/3的稳定性,为动物囊型包虫病的诊断抗原的选择提供参考。本实验通过PCR扩增Eg-AgB8/1、Eg-AgB8/2、Eg-AgB8/3和Eg-AgB8/5的基因序列,原核表达获得重组蛋白抗原B（r Eg-AgB8/1、r Eg-AgB8/2、r Eg-AgB8/3和Eg-AgB8/5）;通过免疫印迹法初步评估在相同蛋白浓度条件下（0.6mg/ml）不同亚型r Eg-AgB8抗原作为绵羊囊型包虫病诊断抗原的敏感性。同时,通过检测绵羊莫尼茨绦虫阳性血清、山羊脑多头蚴阳性血清、山羊细颈囊尾蚴阳性血清和山羊肝片吸虫阳性血清各4份初步评估不同亚型r Eg-AgB8抗原作为绵羊囊型包虫病诊断抗原的特异性。此外,还测定r Eg-AgB8/1、r Eg-AgB8/2、r Eg-AgB8/3在不同p H、室温（25℃）不同时间段及不同储存温度下的蛋白稳定性。生物信息学分析发现:Eg-AgB8/1和Eg-AgB8/2均含有信号肽,而Eg-AgB8/3和Eg-AgB8/5均不含信号肽。通过原核表达获得了r Eg-AgB8/1、r Eg-AgB8/2、r Eg-AgB8/3和r Eg-AgB8/5蛋白,免疫印迹实验结果显示:4种不同亚型的重组抗原B均能被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清所识别。4种不同亚型的重组抗原B在相同蛋白浓度（0.6mg/ml）下通过免疫印迹的方法比较其敏感性,结果表明其敏感为:r Eg-AgB8/3>r Eg-AgB8/2>r Eg-AgB8/1>r Eg-AgB8/5。同时,通过免疫印迹检测绵羊莫尼茨绦虫阳性血清、山羊脑多头蚴阳性血清、山羊细颈囊尾蚴阳性血清和山羊肝片吸虫阳性血清各4份以比较其特异性,结果表明其特异性为:r Eg-AgB8/2>r Eg-AgB8/5>r Eg-AgB8/3>r Eg-AgB8/1。在4℃,p H=5条件下3个重组抗原B的稳定性为:r Eg-AgB8/3>r Eg-AgB8/2>r Eg-AgB8/1;在4℃,p H=7条件下3个重组抗原B的稳定性为:r Eg-AgB8/3>r Eg-AgB8/1>r Eg-AgB8/2。在最适p H条件及室温（25℃）环境下使用超微量分光光度计测定r Eg-AgB8/1、r Eg-AgB8/2和r Eg-AgB8/3不同时间段2h、4h、6h、8h、10h、16h和24h的蛋白浓度。结果显示其稳定性为:r Eg-AgB8/3>r Eg-AgB8/1>r Eg-AgB8/2。同时,r Eg-AgB8/1、r Eg-AgB8/2和r Eg-AgB8/3在最适p H及不同温度（4℃、-20℃和-80℃）条件下储存,使用超微量分光光度计每周测定蛋白浓度,连续测定7周。结果显示:-80℃条件下蛋白降解速度最慢,3个重组抗原B在不同储存温度条件下稳定性为:r Eg-AgB8/3>r Eg-AgB8/1>r Eg-AgB8/2。通过抗原敏感性、特异性和稳定性分析,这4个重组蛋白中,以r Eg-AgB8/3更适合作诊断抗原。
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