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目的：
探讨VEGFsiRNA体外转染试验对未足月胎儿缺氧视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)VEGF表达和细胞增殖的影响,为ROP的防治寻找新的途径。
材料与方法：
1.取孕22-28周,体重1000g-1400g引产胎儿的眼球,利用胰酶、I型胶原酶双酶法消化其视网膜神经上皮层组织,含10％胎牛血清的人内皮细胞培养基(Human EndothelialSFM)添加内皮生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加物等,原代培养视网膜微血管内皮细胞,免疫荧光第Ⅷ因子相关抗原(vWF)、CD34染色进行细胞鉴定。
2.采用化学缺氧剂氯化钴CoCl2(终浓度150μM)建立诱导模型：摸索胎儿视网膜微血管内皮细胞缺氧诱导模型中CoCl2的合适药物浓度。RT-PCR和Western blot分别检测VEGF mRNA和蛋白在缺氧不同时段胎儿hRMFCs中的表达水平。
3.设计、合成VEGFsiRNA,同时取磷酸甘油醛脱氧酶(GAPDH)siRNA作为阳性对照,cy-3标记一段与任何人类基因均不同源的阴性对照siRNA,利用阳离子脂质体转染入胎儿hRMECs,优化转染条件,荧光显微镜观察细胞吞噬siRNA的百分率作为形态学意义上的转染效率。
4.筛选出基因沉默效率最高的一条VEGFsiRNA转染缺氧未足月胎儿hRMECs,孵育12、24、48、72h后,荧光定量RT-PCR检测VEGF mRNA的变化,Western blot检测VEGF蛋白的表达。噻唑兰比色法(MTT法)观察VEGFsiRNA对缺氧和常氧状态下培养的视网膜微血管内皮细胞增殖的影响。
结果：
1.成功分离、培养未足月胎儿视网膜微血管内皮细胞,经第Ⅷ因子相关抗原和CD34染色鉴定,纯净度分别为99％和97％。传至7-8代时细胞形态向成纤维细胞转变,不再继续生长。
2.150μM浓度的CoCl2可以促进细胞增殖.缺氧后VEGF mRNA在胎儿hRMECs中的表达水平明显上升,缺氧12、24、72h时VEGF mRNA的表达量分别为常氧对照组的1.8倍(P>0.05)、2.8倍(P<0.05)、3倍(P<0.05)。缺氧后胎儿hEMECs VEGF蛋白表达量亦上调,48、72h的表达量分别为常氧对照组的4.07倍(P<0.05)和8.39倍(P<0.05)。
3.脂质体转染试剂siPORT NeoFX可以高效地转染siRNA,经过优化各项条件系数,对cy-3 labeled negative control siRNA的转染效率为75％。
4.缺氧环境中的胎儿hRMECs瞬时转染VEGFsiRNA 12、24、72h后,VEGF mRNA表达量分别下降66％(P<0.05)、22％(P<0.05),17％(P>0.05)。瞬时转染VEGFsiRNA 12、48、72h后,VEGF蛋白表达分别下降14.2％、62.3％、73.5％,与对照组比较,统计学处理具有显著性差异(P<0.05)。瞬时转染siRNA 12、48、72h后缺氧组有活力的细胞数分别为69％、75％、89％,与空白对照组、阴性对照组之间均有显著性差异(P<0.05)。
结论：
1.胎儿视网膜微血管内皮细胞的原代培养具有可行性。
2.用150μM的CoCl2可以成功诱导胎儿RECs模拟缺氧,且对细胞生长无抑制。在发生缺氧的胎儿hRMECs,VEGFmRNA和蛋白表达水平明显上调。
3.经过优化转染条件,刚离子脂质体siPORT NeoFX可以将化学合成的siRNA高效地转染进胎儿hRMECs。根据siRNA的设计原则设计、合成的针对靶基因不同位点的多条VEGFsiRNA链均能导致目的基因表达下降。
4.胎儿hRMECs瞬时转染VEGFsiRNA后目的基因mRNA和蛋白的表达均被显著抑制。有效浓度的VEGFsiRNA对缺氧环境中的内皮细胞生长、增殖有抑制作用。
5.体外试验证明siRNA可高效、特异地沉默VEGF的表达,抑制视网膜微血管内皮细胞的异常增殖,有望成为防治视网膜新生血管的新途径。