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环曲病毒（Torovirus,ToV）属于套式病毒目（Nidovirales）,可感染包括哺乳动物、爬行动物以及鱼类等多种宿主。根据国际病毒分类委员会（ICTV）第十次报告,将环曲病毒正式从冠状病毒分离出来,单独形成一个亚目。猪环曲病毒（porcine torovirus,PToV）作为环曲病毒亚科成员之一,是引起仔猪腹泻的潜在病原体,其基因组变异较大,存在高重组风险以及跨种传播的潜能;同时其独特的分类地位（处于动脉炎病毒科和冠状病毒科之间）,是研究套式目病毒进化的重要环节,解析其关键基因的结构与功能,对理解套式目病毒的进化具有重要意义。在套式目病毒编码的多个蛋白中,3C样蛋白酶(3CLpro),又称主蛋白酶,可以识别并切割病毒编码的多聚蛋白pp1a和pp1ab生成多个成熟的非结构蛋白,在病毒的复制过程以及致病机理方面扮演着十分重要的角色,是抗病毒药物设计的重要靶点之一。对于套式病毒目3CLpro结构和功能的了解,为靶向3CLpro广谱抑制剂的研究提供理论依据。目前,对套式病毒目中冠状病毒3CLpro和动脉炎病毒3CLpro的结构和功能已经有部分了解,但是对环曲病毒3CLpro的了解还知之甚少,这在一定程度上阻碍了套式病毒目3CLpro结构与进化关系的深入研究。因此,本研究以PToV3CLpro为切入点,解析PToV 3CLpro具体氨基酸组成及其底物识别特性,建立酶活检测方法,并筛选针对PToV 3CLpro的小分子抑制剂。具体研究内容如下:1.猪环曲病毒（PToV）HB1株的全基因组序列测定为了更好地了解近期流行的PToV变异程度,首先根据Gen Bank上已公布的环曲病毒科病毒的序列比对,选取基因组中保守的核苷酸序列区域作为特异性扩增引物,共设计22对可覆盖全基因组的引物。以临床采集的仔猪腹泻粪便样本为实验材料进行流行病学调查,选取其中一份PToV阳性的仔猪粪样进行全基因组测序,并将其命名为PToV HB1。通过反转录、PCR扩增、克隆及测序获得22个片段测序结果,将其拼接得到PToV HB1株全基因组序列。序列分析显示PToV HB1株全长共28276 bps。对其分子变异和进化特点进行分析,发现该序列与之前报道的PToV毒株的核苷酸同源性仅为92%,提示PToV病毒变异较大。基因组构成分析显示该病毒与其它环曲病毒基因组构成相似,主要由6个开放性阅读框组成（ORF1a、ORF1b、S、M、HE和N）。2.鉴定猪环曲病毒3C样蛋白酶的具体氨基酸组成及其底物特异性为了鉴定PToV 3CLpro具体氨基酸组成,首先以PToV HB1毒株为模板,克隆预测的PToV 3CLpro及其两端侧翼序列,通过原核表达以及Edman降解法对自切割条带进行N端测序,发现成熟的PToV 3CLpro具体区域为ORF1a 3096-3382 aa。随后的定点突变实验表明,PToV 3CLpro是一种丝氨酸蛋白酶,催化中心由His53和Ser160组成。进一步利用基于环化萤光素酶的生物传感器系统地扫描了PToV多聚蛋白的3CLpro切割位点,发现PToV 3CLpro识别底物最典型的特征为识别底物P1位的谷氨酰胺（Gln,Q）。此外,底物P4位也相对保守,为苯丙氨酸（Phe,F）。有趣的是,与大多数套式目病毒3CLpro不同,P1-Gln残基不是PToV 3CLpro进行N端自切割的充分决定因素,而是由P1和P4残基协同影响的。随后的同源模建和生物学实验表明,PToV 3CLpro与底物之间形成了明显的S1和S4口袋,将S1（D159A,H174A）或S4（P62G/L185G）口袋的关键氨基酸突变后,PToV 3CLpro切割底物的能力完全丧失,证实S1和S4口袋在蛋白酶切割底物过程中起到重要的作用。3.基于细胞水平的PToV 3CLpro酶活检测方法的建立及抑制剂筛选为了建立PToV 3CLpro酶活检测方法,将PToV 3CLpro的切割底物短肽序列（nsp3/nsp4）克隆到环化萤光素酶载体中,建立了一种可在细胞水平检测PToV3CLpro蛋白酶活性的方法,剂量依赖性实验及酶活突变实验证实该方法能有效反映PToV 3CLpro的切割特异性以及蛋白酶活性。利用建立的酶活检测方法筛选天然产物库中可特异性靶向PToV 3CLpro的抑制剂,发现4种天然产物能显著抑制PToV 3CLpro的蛋白酶活性。进一步选择抑制活性强、细胞毒性小的白藜芦醇衍生物（3,4’,5-三甲氧基-反式二苯乙烯,3,4’,5-Trimethoxy-trans-stilbene,MR-3）进行后续研究,发现MR-3除了抑制PToV 3CLpro酶活外,还能抑制冠状病毒PEDV 3CLpro和动脉炎病毒PRRSV 3CLpro的蛋白酶活性,且呈剂量依赖性,提示MR-3极有可能是针对套式目病毒3CLpro的广谱抑制剂。4.白藜芦醇及其衍生物抑制套式目病毒增殖的研究为了探讨白藜芦醇成分抗套式目病毒的应用潜力,本研究以多种已分离培养的套式目病毒（冠状病毒:PEDV、PDCoV、MHV;动脉炎病毒:PRRSV）为模型,选取抗PEDV能力强的白藜芦醇衍生物,对其抗套式目病毒的能力及机制进行研究。首先体外生化实验证实6种白藜芦醇衍生物中MR-3和白皮杉醇可显著抑制PEDV3CLpro酶活,其中白皮杉醇表现出更好的抑制活性。随后的抗病毒实验也证实了白皮杉醇显著抑制PEDV增殖,且在6种白藜芦醇衍生物中抑制能力最强。复制周期实验发现白皮杉醇抑制PEDV吸附阶段和复制阶段,对PEDV有一定的直接灭活作用。然而,相比于抑制PEDV增殖能力而言,白皮杉醇抑制PDCoV和MHV增殖能力减弱,对PRRSV几乎没有抑制能力,体外酶活实验结果也显示白皮杉醇对PRRSV3CLpro活性没有抑制能力,证实白皮杉醇的抗病毒能力具有种属特异性。综上所述,本研究发现白皮杉醇可显著抑制多种冠状病毒（PEDV、PDCoV和MHV）的增殖,且可能与抑制其3CLpro的酶活相关。总之,本研究测定了猪环曲病毒（PToV）HB1株的全基因组序列,鉴定了PToV3CLpro的自切割活性和底物特异性。在此基础上,利用PToV 3CLpro切割底物特性构建了基于细胞的PToV 3CLpro酶活检测方法,并利用该方法筛选天然产物库中特异性靶向PToV 3CLpro的抑制剂,并在病毒水平证实候选药物白皮杉醇具有广谱的抗冠状病毒活性,为今后开发更安全有效的广谱抗冠状病毒药物奠定了理论基础。