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家蚕既是重要的经济昆虫,也是重要的模式生物。谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是一类由多基因编码的多功能同工酶超家族,广泛分布在动物、植物、酵母和细菌等生物体中,该酶系在解毒内源和外源性有毒物质中起着重要作用。随着社会经济的迅速发展,越来越多的有机农药应用于农业生产中,但是伴随而来的是昆虫的抗性也随之加强。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,研究家蚕谷胱甘肽-S-转移酶的表达模式和调控机制,对于阐明谷胱甘肽-S-转移酶与杀虫剂抗性的关系,防治农林害虫有着重要的理论意义,本文采用生物信息学分析方法,依据家蚕基因组数据库和EST数据库信息,预测到家蚕的谷胱甘肽-S-转移酶基因BmGSTe3,采用RT-PCR方法分析了其组织表达特性并进行了序列分析。利用基因工程技术,克隆谷胱甘肽-S-转移酶后,通过杆状病毒表达载体系统构建真核表达载体,对谷胱甘肽-S-转移酶基因进行了外源表达,初步建立和探索出了一条在昆虫细胞中表达谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的路线。1.BmGSTe3基因的克隆和序列分析克隆了家蚕的BmGSTe3基因,该基因的完整编码区序列长度为651bp,由5个外显子与4个内含子组成,且所有的外显子/内含子拼接边界均符合典型的GT-AG规则,外显子总长度为512bp,每个外显子长度都不超过250bp。内含子总长度为4792bp,其中第一内含子最长,为1771bp,第二内含子最短,为788bp。BmGSTe3包含N-末端和C-末端两个结构域,N-末端由β-α-β-α-β-β-α共7个结构基序组成,而C-末端则由5个α螺旋构成,有一个保守的Ser催化位点以神经网络启动子预测分析发现BmGSTe3有1个TATA盒,在上游2500bp区域内搜寻相关调控元件时,共发现了15个可能的转录调控元件,分别是:XRE(1)、ARE(4)、TRE(5)和NF-kB(5)。系统发生树明显分为四大类群,分别是Dlata、Epsilon、Theta和Zeta四大类。而家蚕BmGSTe3与昆虫特异的Epsilon家族聚为一类。2.BmGSTe3基因组织表达特性BmGSTe3表达模式分析表明,BmGSTe3基因只有血淋巴和头部有表达,在其余6个组织中不表达,并且在头中表达量较血淋巴中高。表明BmGSTe3基因的表达具有较高的组织特异性。3.重组转移载体和杆状病毒载体的构建与鉴定利用基因重组技术将重组克隆质粒PMD18-T/BmGSTe3和转移载体pFastBacHTA进行了杆状病毒转移载体构建,得到了重组转移载体pFastBacHT A-BmGSTe3。将重组的转移载体pFastBacHTA-BmGSTe3转化大肠杆菌DH10Bac,获得了含有BmGSTe3基因的重组病毒Bac-BmGSTe3。4.BmGSTe3基因的真核表达运用cellfectin转染试剂将重组病毒转染进入sf9细胞后,经SDS-PAGE分析鉴定,比较蛋白条带,结果发现感染重组杆状病毒Bacmid-BmGSTe3的细胞有一约为28KD左右的目的特异蛋白条带表达。5.GSTs酶活性测定以CDNB作底物,对重组表达蛋白酶进行初步的酶活性测定,结果表明外源表达的GST蛋白酶具有较好的生物学活性,为BmGSTe3蛋白进一步的功能研究奠定了基础。