论文部分内容阅读
胰腺癌是一种恶性程度很高,诊断和治疗都很困难的消化腺恶性肿瘤,是目前最严重的癌症之一,病理类型包括导管腺癌、腺泡细胞癌、小腺体癌、大嗜酸性颗粒细胞性癌等,其中胰腺导管腺癌是胰腺癌中最常见的一种,占胰腺癌发病率的95%,往往晚期时才被发现。目前胰腺癌最有效的治疗手段是手术切除,但是5年生存率仍不足6%,因此发现新的检测胰腺癌特异性的分子探针,寻找新的肿瘤标志物,对于胰腺癌的防治具有重要的作用。为了获得特异性识别胰腺导管腺癌的核酸适配体,我们合成了ssDNA文库,以人胰腺导管腺癌细胞系PL45为靶标细胞,以人永生化胰腺导管上皮细胞系hTERT-HPNE为对照细胞,进行cell-SELEX筛选。通过15轮筛选,发现ssDNA库达到最大富集。利用高通量测序技术,根据序列的同质性,分成了六个家族,挑选了每个家族的第一条用于进一步的鉴定,发现XQ-2能特异性结合人胰腺导管腺癌细胞系PL45,而不结合对照细胞系hTERT-HPNE,结合人胰腺导管腺癌细胞系PL45的解离常数约为82.5nM。通过逐渐删减两端固定序列的方式对筛选出的核酸适配体XQ-2的序列进行分析优化,流式细胞术结果表明经过删减后的核酸适配体XQ-2d与靶细胞PL45的结合能力更强。为了提高核酸适配体在复杂环境中的稳定性,对删减后的核酸适配体XQ-2d进行了化学修饰,发现经甲氧基修饰的删减后的核酸适配体,不仅保持了与靶细胞高效的结合能力,还可以明显提高其稳定性,这有利于其在生物医学中的应用。为了考察核酸适配体在复杂生物环境下的识别性能,本文表征了核酸适配体与临床病理石蜡组织切片以及小鼠活体肿瘤的结合情况,切片结果表明核酸适配体对癌组织的识别效率高达82.5%,远远高于对正常组织的识别。在小鼠活体肿瘤实验中,尾静脉注射5分钟后,在肿瘤位置开始富集,60分钟后富集达到最强,180分钟后肿瘤位置仍有信号,表明核酸适配体在复杂环境中仍能保持良好的识别能力,并且保持高度的组织特异性。目前胰腺导管腺癌的肿瘤标志物较少,无特异性,且用途不广,十分有必要发现胰腺导管腺癌新的肿瘤标志物十分有必要,本文利用生物质谱、siRNA干扰技术、流式细胞术、SDS-PAGE、western blot等技术成功发现并验证了核酸适配体的靶标蛋白转铁蛋白受体1,利用核酸适配体与其靶标蛋白转铁蛋白受体1特异性结合的特性,发现的这种蛋白质有望作为胰腺导管腺癌新的肿瘤标志物,为胰腺导管腺癌的治疗提供了新的方法和思路。