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研究背景卵巢癌是五大发病率较高的女性恶性肿瘤之一,妇女的生命和健康受到严重的威胁。由于卵巢癌起病隐匿,大部分患者发病时都在晚期,患者的生存率和生存质量比较低,迄今为止临床上对卵巢癌的治疗依然面临巨大的挑战。因此,深入阐明卵巢癌致病的分子机制是提高临床上卵巢癌诊断和治疗的关键。卵巢癌干细胞(CSCs)是一群具有多能的和胚胎样的表型,并且具有自我更新和无限增殖能力的细胞。目前卵巢癌干细胞方向的学术研究越来越受到科研人员的关注,研究已经发现卵巢癌中卵巢癌干细胞在卵巢癌发生发展、侵袭、转移、化疗耐药和复发中起了重要的作用,因此在临床上能兼顾卵巢癌干细胞和普通干细胞的治疗策略才是真正有效的治疗。随着对于卵巢干细胞研究的不断深入,对卵巢癌干细胞转移、分化等生物学特性和分子机制的进一步了解将有助于建立有效的卵巢癌治疗方案。因此,深入研究卵巢癌干细胞具体分子机制具有重要的意义。近期有研究发现促炎性细胞因子和趋化因子介导了众多肿瘤干细胞自我更新和分化的作用,因此我们推测卵巢癌干细胞为了保持其自我更新和分化的能力,可能也产生了大量炎症因子及其受体。目的探讨炎症因子及其受体对卵巢癌干细胞自我更新的影响,同时进一步分析IL-23及其受体介导的卵巢癌干细胞自我更新的生物学特性及具体分子机制,从而为探寻新的卵巢癌治疗分子靶向物质提供充分的实验依据。方法1.应用RT2Profiler?PCR array比较卵巢癌干细胞与非卵巢癌干细胞之间炎症相关因子的表达差异。并运用western blotting、ELISA、Real-time PCR、免疫荧光和流式细胞仪检测等方法对PCR array的结果进行验证。2.应用球体形成实验分析IL-23对卵巢癌干细胞样细胞自我更新特性的影响。球体形成实验中我们采用三种不同的方法降低IL-23的水平并且观察球体形成能力的变化。这三种不同方法分别是添加不同溶度的IL-23中和抗体和不同溶度的阿吡莫德(STA-5326)及转染sh-IL-23p19基因慢病毒载体。3.应用Western blotting和免疫荧光检测IL-23抑制剂(STA-5326)处理和转染IL-23p19干扰RNA的卵巢癌干细胞中卵巢癌干细胞标志物Nanog,Oct4 and Sox2的表达。4.裸鼠移植瘤实验检测IL-23对卵巢癌CSCs成瘤能力的影响,同时统计裸鼠的生存率和测量肿瘤的体积和重量。成瘤实验中裸鼠分别皮下注射sh-IL-23p19基因转染和IL-23(ST-5326)处理的卵巢癌CSCs及各对照组。5.应用western blotting和免疫荧光检测IL-23抑制剂(STA-5326)处理和sh-IL-23p19基因转染的卵巢癌干细胞中STAT3、磷酸化STAT3和P65(NF-κB活性单元)的表达情况。此外,于sh-IL-23p19基因转染的卵巢癌干细胞中添加不同溶度的人重组IL-23(rh IL-23)并且采用葫芦素(STAT3抑制剂)和PDTC(NF-κB抑制剂)处理后,成球实验检测球体的数量。6.应用Real-time PCR检测恶性卵巢癌患者组织标本中IL-23、CD133、Nanog,Oct4 and和Sox2的表达水平。HE染色进一步确定组织标本的分化程度。结果1.RT2Profiler?PCR array结果发现与CD133-非卵巢癌干细胞相比较CD133+卵巢癌干细胞某些炎症因子及受体高表达,例如IL-1、IL-8 IL-15、IL-23及IL-23R。并且通过real-time PCR、ELISA、免疫荧光、western blotting和流式细胞仪检测的方法得到证实。2.成球实验结果显示卵巢癌干细胞中添加不同溶度的IL-23中和抗体和不同溶度的阿吡莫德(STA-5326)及转染IL-23p19干扰RNA慢病毒载体均能降低干细胞“球体”的数量,其中添加不同溶度的阿吡莫德(STA-5326)及转染IL-23p19干扰RNA慢病毒载体呈剂量依赖效应。同时三种不同的方法减弱IL-23的表达水平后卵巢癌干细胞“球体”的体积也相应减小。3.Western blotting和免疫荧光检测结果显示IL-23抑制剂(STA-5326)处理或IL-23p19干扰RNA转染的卵巢癌干细胞中卵巢癌干细胞标志物Nanog,Oct4 and Sox2的表达水平均降低。4.裸鼠移植瘤实验检测结果显示皮下注射转染IL-23p19干扰RNA的卵巢癌干细胞的裸鼠组能显著降低老鼠的发病率并且能提高其生存率,而皮下注射采用阿吡莫德(STA-5326)处理的卵巢癌干细胞的裸鼠组也能降低老鼠的发病率并且肿瘤的重量也降低,但是并不能提高老鼠的生存率。5.Western blotting和免疫荧光检测结果显示IL-23抑制剂(STA-5326)处理和IL-23p19干扰RNA转染的卵巢癌干细胞中STAT3、磷酸化STAT3和P65(NF-κB活性单元)的表达水平均降低,并且磷酸化STAT3的表达水平与STA-5326呈剂量依赖。此外,于IL-23p19干扰RNA转染的卵巢癌干细胞中添加不同溶度的人重组IL-23(rh IL-23)和葫芦素(STAT3抑制剂)或PDTC(NF-κB抑制剂),卵巢癌干细胞成球实验显示加入葫芦素(STAT3抑制剂)及PDTC(NF-κB抑制剂)后细胞成球数量显著降低。6.恶性卵巢癌患者组织标本中Real-time PCR检测和HE染色结果显示高表达IL-23p19的卵巢癌组织标本中表现出低分化状态,并且RNA水平中IL-23p19的表达与CD133、Nanog、Oct4呈正相关。结论1.CD133+卵巢癌干细胞同时高表达炎症因子IL-23及受体。2.体外实验显示IL-23能促进CD133+卵巢癌干细胞的自我更新能力并且在维持干细胞标志物的稳定表达上具有重要作用。3.体内实验显示IL-23能维持CD133+卵巢癌干细胞的致瘤潜能。4.IL-23能通过激活STAT3和NF-κB信号通路能介导CD133+卵巢癌干细胞的自我更新和肿瘤的形成。5.人体卵巢癌组织标本中,IL-23高表达者表现出低分化的组织状态并且和干细胞标志物CD133,Nanog和Oct4的表达水平正相关。