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肺癌是目前世界范围内发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一,根据组织类型的不同,主要分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC),其中前者约占肺癌的85%左右。由于肺癌早期发病临床症状多不明显,多数非小细胞肺癌患者就诊时已属晚期。近年来,尽管免疫治疗、靶向治疗等治疗手段不断发展,化疗仍然是晚期、无驱动基因突变患者的主要治疗方式之一。以铂类药物为基础的联合化疗是晚期非小细胞肺癌的一线化疗方案,其中顺铂(cisplatin,CDDP)是目前临床最常用的铂类药物之以往的研究证实,顺铂可直接杀伤肿瘤细胞,其进入肿瘤细胞后,可造成DNA损伤、干扰DNA复制,从而抑制肿瘤细胞分裂增殖、导致肿瘤细胞程序性死亡。此外,顺铂等药物除了对肿瘤细胞的直接杀伤作用外,其也会影响肿瘤所在微环境中间质细胞、免疫细胞的浸润和功能,进而影响肿瘤的转归和治疗疗效。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是微环境的重要组成部分,具有干细胞特性,参与组织损伤修复等过程。研究证实,MSCs是肿瘤微环境的重要组成之一,其可在肿瘤细胞等来源的多种分泌因子作用下从骨髓迁移至肿瘤局部;参与调控肿瘤细胞凋亡、上皮间质转化、干细胞增殖、血管形成及局部免疫应答等过程,从而影响肿瘤发展和转归。但是关于顺铂对MSCs功能影响的研究甚少。MSCs主要通过其分泌的多种细胞因子、趋化因子促进肿瘤局部免疫细胞浸润、调控免疫应答来影响肿瘤发展。白细胞介素(interleukin,IL)-6是由多种细胞产生的参与机体多项反应的细胞因子,其可调控免疫细胞增殖、分化,同时也可募集单核-巨噬细胞等从外周循环至肿瘤局部,参与调控肺癌等多种恶性肿瘤的发生发展。单核细胞或巨噬细胞从外周血迁移到达肿瘤局部后,在多种因子的作用下分化为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,TAMs),其通过促进肿瘤增殖与侵袭转移、刺激肿瘤血管形成和导致免疫抑制等发挥促肿瘤作用。本论文研究通过体外试验较为系统地研究了顺铂对MSCs表达细胞因子和趋化因子的影响,探究了参与这些影响的信号通路,并验证了其对巨噬细胞的趋化作用。第一部分顺铂对肿瘤间充质干细胞细胞因子、趋化因子表达的影响研究目的:通过体外试验研究顺铂对MSCs的作用,探讨顺铂对MSCs细胞因子、趋化因子表达的影响,筛选出其中显著改变的细胞/趋化因子。研究方法:1.采用贴壁分离、免疫磁珠负分选及流式细胞术再分选纯化的方法从C57/BL6小鼠骨髓中分离、纯化MSCs,并根据国际细胞治疗协会标准对分离纯化的细胞进行鉴定;2.常规培养MSCs,采用不同浓度、不同作用时间的顺铂处理MSCs,细胞增殖活性实验(CCK-8)检测细胞活力,研究顺铂对MSCs的抑制作用;3.用顺铂处理MSCs后,聚合酶链反应阵列(PCRArray)检测顺铂处理后细胞因子、趋化因子的表达改变;4.分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、酶联免疫吸附实验(ELISA)从mRNA和分泌蛋白水平进一步检测、验证IL-6等因子的表达改变;5.顺铂处理小鼠肺癌细胞Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞后,qRT-PCR、ELISA分别检测IL-6 mRNA和分泌蛋白水平的表达改变。研究结果:1.成功建立了小鼠MSCs细胞株,并从表型、功能等方面进行了验证;2.顺铂对MSCs具有显著的抑制作用,且抑制作用与顺铂作用的浓度、时间和MSCs细胞数量有关。随着作用浓度的增加(00μmol/L-50μmol/L)或作用后时间的延长(6h-72h),细胞抑制率逐渐增高(0%-99.83%);药物处理前MSCs接种细胞数量也影响顺铂对MSCs的抑制作用,随着细胞数量的减少(96孔板中:5000-1000个细胞/孔)或作用后时间的延长(24h-72h),顺铂的抑制作用逐渐增强(0%-99.64%)。3.顺铂作用于MSCs后,PCR Array检测结果表明:(1)作用后0h:MSCs中无细胞因子或趋化因子基因表达升高,多数降低;(2)作用后6h:趋化因子CC基元配体(Chemokine CC-motifligand,CCL)家族中CCL-2、CCL-20、CCL-5和CCL-7分别升高8.82、1.93、2.72和9.79倍;趋化因子CXC基元配体(Chemokine C-X-Cmotifligand,CXCL)家族中CXCL-1、CXCL-10、CXCL-16、CXCL-3和CXCL-5分别升高2.53、1.55、1.09、1.79、1.58倍;IL家族中 IL-2、IL-22、IL-6和 IL-7 分别升高 1.53、1.89、14.34和1.12倍,其中IL-6基因升高最明显;(3)作用后24h:CCL家族中CCL-2、CCL-20、CCL-4、CCL-5和CCL-7分别升高 6.10、2.19、2.11、44.62 和 9.51 倍;CXCL 家族中的 CXCL-1、CXCL-10、CXCL-16和CXCL-3分别升高4.56、106.86、6.91、4.56倍;IL家族中IL-15、IL-17f、IL-8、IL-6、IL-7和IL-9分别升高2.53、24.93、2.22、21.11、7.78和5.77倍。4.顺铂处理肺癌LLC细胞后3h、24h后,IL-6mRNA和蛋白表达均未见有统计学意义的改变(正常对照组vs顺铂处理组:mRNA:3h:P=0.089;24h;P=0.073;蛋白:3h:P=0.149;24h;P=0.149)。5.qRT-PCR和ELISA检测结果表明,顺铂作用后MSCs的IL-6 mRNA和蛋白表达差异均具有统计学意义(P<0.001)。(1)3、6、24h时,IL-6 mRNA表达分别升高了 1.67、2.83和 10.15倍(3 h:P=0.218;6h:P=0.007;24h:P<0.001),随着顺铂作用后时间延长,IL-61 mRNA表达水平逐渐增高(3h vs 6h:P=0.050;3 h vs 24 h:P<0.001;6 h vs 24h:P<0.001);(2)3、6、24 h 时,IL-6蛋白分泌水平升高了3.28、5.71、6.69倍(3 h:P=0.001;6h:P<0.001,24 h:P<0.001),随着顺铂作用后时间延长,IL-6分泌水平逐渐增高(3h vs 6h:P=0.001;3h vs 24h:P<0.001;6h 6h vs 24h:P=0.074)。研究结论:我们成功分选、纯化了小鼠MSCs,并从表型、功能等方面进行了鉴定。顺铂处理MSCs后,多种细胞因子、趋化因子的表达发生了显著改变,其中IL-6的表达上调最为显著。而对于小鼠肺癌LLC细胞,顺铂处理后,其IL-6的表达未见显著改变。这些结果提示,顺铂作用于肿瘤微环境后,MSCs是IL-6的主要来源之一,其表达显著增高。第二部分顺铂调控肿瘤间充质干细胞IL-6表达的机制研究研究目的:探讨、阐明顺铂调控IL-6在MSCs表达的可能参与信号通路,并研究MSCs来源的IL-6表达改变对巨噬细胞趋化的影响。研究方法:1.按实验目的,设立以下分组:(1)正常对照组:常规培养的MSCs;(2)顺铂处理组:5μmol/L顺铂处理MSCs 6 h;(3)抑制剂组:采用10μmol/L SB20358(p38MAPK通路抑制剂)处理MSCs;(4)IL-6抗体组:培养基中含有0.03)μg/mL的IL-6阻断抗体;(5)阴性对照组:只含DMEM;(6)阳性对照组:0.25ng/mL的IL-6重组蛋白。2.顺铂处理MSCs后,提取总蛋白,western blotting检测正常对照组和顺铂处理组p38MAPK通路的表达改变;3.采用特异性抑制剂SB20358抑制p38MAPK通路,ELISA检测顺铂处理后MSCs IL-6的表达改变;4.采用Transwell系统检测顺铂处理组MSCs及正常对照组MSCs对RAW264.7巨噬细胞的趋化作用;5.通过IL-6阻断抗体阻断等方法等研究MSCs来源IL-6对RAW264.7巨噬细胞的趋化作用。研究结果:1.顺铂处理MSCs3、6、24h后,p38和pp38的蛋白表达明显增强,pp38/p38比值明显升高,具有统计学差异(正常对照组vs顺铂处理组:3h:P<0.001;6h:P=0.019;24h:P<0.001),p38MAPK通路明显活化;2.采用特异性抑制剂抑制p38MAPK通路后,顺铂对IL-6在MSCs的上调表达部分被抑制,IL-6的表达显著下降(正常对照组vs顺铂处理组:3 h:P<0.001;6 h:P<0.001;24 h:P<0.001);3.顺铂处理后MSCs对RAW264.7巨噬细胞的趋化作用显著增强(顺铂处理组vs正常对照组:P<0.001);4.采用IL-6阻断抗体阻断IL-6功能后,顺铂处理后的MSCs对RAW264.7巨噬细胞的趋化作用显著下调(顺铂处理组vs IL-6抗体组:P<0.001)。研究结论:顺铂处理MSCs后p38MAPK通路被显著激活,通过抑制剂特异性抑制该通路证实其参与调控IL-6在MSCs的表达;顺铂处理后MSCs对RAW264.7巨噬细胞的趋化作用显著增强,阻断试验表明这一作用部分是通过IL-6介导的。