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研究背景皮肌炎(Dermatomyositis,DM)和多发性肌炎(Polymyositis,PM)是特发性炎性肌病(Idiopathic inflammatory myopathy,IIM)中的两种重要亚型。前者以皮肤受累为主,伴或不伴肌肉受累,后者以肌肉受累为主。但DM/PM也可累及皮肤及肌肉外器官,如血管炎、关节炎、雷诺现象、间质性肺病(Interstitial lung disease,ILD)等,其中ILD是影响DM/PM预后的一个重要因素,特别是急性进展性ILD(Rapidly progressive interstitial lung disease,RPILD)预后极差,给家庭和社会带来沉重经济负担。肌炎相关ILD(Myositis-associated ILD,MA-ILD)发病机制主要基于如下假说:组织内过度的细胞炎症过程不能及时终止,最终进展为纤维增殖状态。病毒感染被认为是MA-ILD发病的原因之一,文献报道丙肝病毒(HCV)与MA-ILD及抗Jo-1相关ILD相关,巨细胞病毒(CMV)与DM相关的RP-ILD相关,细小病毒B19(parvovirus B19)与ILD患者的微血管损伤相关。免疫系统参与ILD发病。细胞免疫与MA-ILD相关,BALF中淋巴细胞比例明显升高,并且CD8+T淋巴细胞明显激活。体液免疫也与MA-ILD相关,文献报道>75%的抗合成酶抗体阳性的肌炎患者伴有ILD。但上述因素与MA-ILD的相关性均为相关性研究,免疫系统导致ILD形成的具体机制目前仍不明确。因此仍需进一步明确DM/PM-ILD的发病机制。尽管病因各异,ILD在临床、生理、病理、影像及发病机制方面具有一致性,均通过共同通路导致肺泡-毛细血管界面受损,最终在HRCT上表现为网状和蜂窝状改变。ILD及肺纤维化发病机制在动物模型和特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)方面研究较成熟,因此DM/PM-ILD发病机制的研究可借鉴IPF。miR-200c及miR-125b与ILD。Micro RNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNA,一般通过与不同蛋白编码基因m RNA的3’非翻译区(3’UTR)结合抑制靶基因的翻译或促进靶基因m RNA降解,从而达到调控基因表达,发挥生理和病理作用的目的。miRNAs参与许多疾病(包括肺纤维化)的生理过程。研究发现miR-200c在实验性肺纤维化模型鼠及IPF患者肺中表达明显下调。而且miR-200c在肺泡上皮细胞中表达较肺成纤维细胞中表达明显升高,引入miR-200c可明显减轻肺纤维化鼠的纤维化程度。因此研究认为miR-200c对维持肺泡上皮细胞表型,抑制上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)具有重要作用,对纤维化形成具有保护作用。miR-125b在许多疾病中也显示抑制或促进疾病进展的特性,例如实体瘤、血液系统肿瘤和自身免疫性疾病等,另外,在急性肺损伤(acute lung injury,ALI)鼠中miR-125b可明显减少BALF中总细胞数及中性粒细胞数、致炎细胞因子及趋化因子数等,从而保护肺组织。在这些疾病中miR-125b主要通过靶向不同的靶基因,影响细胞增殖、分化、迁移等细胞过程,从而影响疾病过程。miR-200c及miR-125b与T淋巴细胞。miR-200c和miR-125b不仅在AECs和肺成纤维细胞的分化、增殖和迁移过程中发挥作用,其对淋巴细胞的增殖、分化、凋亡等细胞周期过程也起重要作用。miR-125b抑制na?ve T细胞分化为效应性T细胞,miR-200c抑制T淋巴细胞反应。T淋巴细胞与ILD。T淋巴细胞在ILDs(包括MA-ILD)的形成中扮演重要作用。研究发现在ILD患者BALF中T淋巴细胞激活较外周血中更明显,在无肌病性皮肌炎合并致死性RP-ILD患者BALF中CD8+T淋巴细胞明显增多。Enelow RI等研究报道在实验性肺疾病中抗原特异性的CD8+T淋巴细胞识别肺泡上皮细胞自身抗原,触发炎症级联反应,导致间质性肺炎。mTOR通路与T淋巴细胞。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)可促进蛋白合成、细胞增殖、生长、分化等各种生物合成过程,mTOR通路广泛参与真核细胞增殖。体内mTOR影响CD8+T淋巴细胞迁移能力以及CD8+记忆性T淋巴细胞的分化能力。miR-200c和miR-125b与mTOR通路。前期生物信息学预测mTOR通路中mTOR下游的两个关键分子S6K和4E-BP1分别是miR-200c和miR-125b作用的靶基因。因此推测miR-200c和miR-125b可能通过调控T淋巴细胞中S6K和4E-BP1表达,从而影响CD8+T淋巴细胞增殖,导致DM/PM相关ILD的形成。鉴于miR-200c、miR-125b及CD8+T淋巴细胞在ILD发病中的作用及前期对这两个miRNAs靶基因的生物信息学预测,本课题组提出miR-200c和miR-125b可能通过影响CD8+T淋巴细胞增殖参与DM/PM-ILD形成的假说,并通过研究miR-200c、miR-125b表达与DM/PM-ILD肺损伤标志物SP-D、TGF-β1的相关性,及miR-200c、miR-125b表达与BALF中CD8+T淋巴细胞比例的相关性,说明miR-200c和miR-125b表达与DM/PM-ILD的相关性。目的1.明确PBMCs中miR-200c及miR-125b表达水平与DM/PM-ILD损伤程度的相关性。2.miR-200c、miR-125b表达与肺损伤标志物的相关性。3.探讨DM/PM-ILD患者肺泡灌洗液中miR-200c及miR-125b表达与CD8+T淋巴细胞比值的相关性,从而初步明确miR-200c及miR-125b促进DM/PMILD形成的可能机制。方法1.安徽省立医院风湿科30例连续住院和门诊DM/PM患者纳入本次研究,所有患者均安排行胸部高分辨CT(HRCT)及肺功能检测(PFT),根据HRCT、PFT及美国胸科学会/欧洲呼吸学会(ATS/ERS)关于ILD诊断标准,判断患者有或无ILD,并将患者组分为无或轻度ILD组(9例)、中度ILD组(10例)及重度ILD组(11例)。23例健康献血员作为健康对照。2.30例DM/PM患者和23例健康对照获取外周血单个核细胞(PBMCs),提取总RNA,逆转录荧光定量PCR(QRT-PCR)检测PBMCs中miR-200c及miR-125b表达水平。比较疾病组与对照组及不同ILD组miRNAs表达水平。9例DM/PM-ILD患者BALF细胞同样方法检测miR-200c及miR-125b表达水平。比较PBMCs及BALF细胞中miRNAs表达水平。3.肺泡灌洗:13例DM/PM-ILD患者纳入经支气管镜行肺泡灌洗,获取BALF,其中9例离心得细胞用于QRT-PCR检测miR-200c及miR-125b表达水平,上清用于ELISA检测TGF-β1和SP-D表达水平。4.TGF-β1和SP-D检测:ELISA检测上述患者血浆和BALF上清中TGF-β1和SP-D的表达。比较DM/PM-ILD患者BALF上清中和血浆中TGF-β1和SP-D表达水平,并分析BALF细胞中miR-200c及miR-125b表达水平与BALF上清中TGF-β1和SP-D表达水平的相关性。5.肺泡灌洗液中细胞分类计数:13例BALF标本均用血细胞计数器进行总细胞计数,涂片Wright-Giemsa染色进行分类细胞计数。6.流式细胞术:13例DM/PM-ILD患者检测BALF中T淋巴细胞亚群,其中10例也行流式细胞术检测PBMCs中T淋巴细胞亚群。计算CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞亚群百分比。分析BALF中miR-200c及miR-125b表达水平与CD8+T淋巴细胞比例的相关性。结果1.DM/PM患者PBMCs中miR-200c及miR-125b表达水平:DM/PM患者PBMCs中miR-200c及miR-125b表达水平较正常对照明显升高(P=0.0006,0.034).2.BALF细胞中miR-200c及miR-125b表达水平与PBMCs中表达水平比较:DM/PM-ILD患者BALF细胞中miR-200c及miR-125b表达水平较PBMCs中均明显升高(P=0.0313,0.0188)。3.PBMCs中miR-200c表达水平在无或轻度ILD组(组1)、中度ILD组(组2)及重度ILD组(组3)表达水平逐渐升高,差异有统计学意义(组1VS组3、组2 VS组3,P=0.0024,0.0083);PBMCs中miR-125b表达水平在无或轻度ILD组(组1)、中度ILD组(组2)及重度ILD组(组3)表达水平逐渐升高,差异有统计学意义(组1 VS组3、组2 VS组3,P=0.0207,0.0133)。4.DM/PM-ILD患者BALF上清中和血浆中TGF-β1和SP-D表达水平比较:BALF上清中TGF-β1较血浆中表达明显升高(525.79(492.67-651.76)ng/m L VS 35.59(18.02-72.25)ng/m L,P=0.0009);BALF上清中SP-D也较血浆中表达升高,但差异无统计学意义(P=0.0799)。5.BALF细胞中miR-200c及miR-125b表达水平与上清中TGF-β1和SP-D表达水平的相关性:9例DM/PM-ILD患者BALF细胞中miR-125b及miR-200c表达水平与BALF上清中SP-D水平呈正相关(P=0.0083,0.002),与TGF-β1无明显相关性(P=0.3333,0.3333)。6.BALF分类细胞计数:BALF中总细胞计数较外周血明显增多(13例均明显>10*10^9/L),并且大多数是中性粒细胞(7例>40%)和淋巴细胞(7例>40%),说明BALF细胞是淋巴细胞为主型(所有标本>15%)和中性粒细胞为主型(所有标本>5%)。7.BALF及PBMCs中T淋巴细胞亚群比较:10例DM/PM-ILD患者,在PBMCs中,除1例CD4+T淋巴细胞比例下降外,其余所有标本中CD3+,CD8+和CD4+T淋巴细胞比例均正常。BALF中CD3+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞比例均较PBMCs中明显升高(P=0.0006,0.0002),而CD4+T淋巴细胞比例较PBMCs中明显下降(P=0.011),CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞较PBMCs中明显下降(P=0.003)。8.BALF中miR-200c及miR-125b表达水平与CD8+T淋巴细胞比例的相关性:BALF中miR-125b和miR-200c表达水平与CD8+T淋巴细胞百分比存在负相关性(P=0.0172,0.0083),与CD4+/CD8+淋巴细胞比值存在正相关性(P=0.002,0.0007)。结论1.DM/PM-ILD患者BALF细胞中存在异常高表达的miR-200c及miR-125b,并且BALF细胞较PBMCs中表达水平明显升高。PBMCs中miR-200c及miR-125b表达水平与DM/PM相关ILD的严重程度呈正相关,BALF细胞中miR-200c及miR-125b表达水平与上清中SP-D水平正相关。上述结果表明miR-200c及miR-125b可能参与DM/PM相关ILD的形成。2.BALF中miR-200c及miR-125b表达水平与异常增多的CD8+T淋巴细胞百分比呈负相关,说明DM/PM-ILD患者BLAF中可能存在miR-200c及miR-125b表达代偿增多以抑制异常增多的CD8+T淋巴细胞对肺组织的损伤。