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研究背景MicroRNA (miRNA);是美国马萨诸塞大学医学院教授Victor Ambros在1993年首次在秀丽隐感线虫体内发现的。它广泛的存在并被发现于真核细胞生物、病毒中的,长度介于21-23nt之间的内源性单链RNA,但是它不编码生成相应的蛋白质而是仅作用于转录后的表达调节。与此同时,美国分子生物学家Gary Ruvkun的实验室学者鉴定出了首个miRNA的目标靶基因,使得其在基因表达中的重要价值被人们初次揭示。自此一种重要的、全新的翻译后的蛋白表达调节方式为人类所发现并不断的进行深入的了解。成熟的miRNA以miRISC复合物的形式特异性识别并结合到目标mRNA的3’UTR区域,以抑制目标mRNA翻译或降解目标mRNA的方式进行转录后调节。学者们已经发现并确定miRNA在细胞的增殖、分化以及细胞周期等行为的调控中起到了重要作用,调控失常与疾病的发生之间密切相关。作为较早被发现的miRNA之一,Let-7b因被众多学者发现与肿瘤的增殖和侵袭等生物学行为密切相关而受到广泛关注。但Let-7b在垂体腺瘤细胞中的靶向目标靶基因及其作用机制尚未被人们所了解。在本实验研究过程中,我们采用目前较为通用、成熟的筛选办法：通过利用当下国际上较为通用的、不同的生物信息学软件系统对Let-7b的目标靶向基因进行初步的筛选鉴定,然后将各软件的筛选结果取交集。我们发现Let-7b与CD1473’UTR之间存在良好的、连续7个碱基之间存在靶向互补关系,Let-7b可能通过CD147作用于细胞部分蛋白的表达并对其生物学行为产生影响。CD147(基质金属蛋白酶诱导剂)属于免疫球蛋白超家族,作为一种重要的生物蛋白参与细胞内多种细胞信号转导并对细胞的功能产生重要的影响。目前已经证实：CD147可以通过促进基质金属蛋白酶-9的表达对肿瘤细胞的侵袭性等生物学行为起到明显的促进作用。在本次的实验研究中,本课题组以大鼠垂体腺瘤GH3细胞为研究对象,体外构建碱基序列,利用慢病毒为载体,侵袭转染以改变GH3细胞中Let-7b的表达水平,通过后续实验方法检测与肿瘤侵袭性密切相关的蛋白CD147、MMP-9表达量变化及细胞的侵袭能力,从而达到明确Let-7b对垂体腺瘤GH3细胞侵袭性生长作用的目的。本实验分为两部分。I MicroRNALet-7b靶向CD147对大鼠垂体腺瘤GH3细胞CD147.MMP-9表达的影响目的讨论Let-7b对大鼠垂体腺瘤GH3细胞CD 147、MMP-9表达的调控作用。方法大鼠GH3细胞株体外培养并进行慢病毒转染,分别转染Let-7b mimic、反义寡核苷酸链(AMO)及空白病毒作为对照组。转染72h后,分别应用RT-PCR检测Let-7b、CD147、MMP-9 mRNA表达量的变化,Western blotting检测CD147、MMP-9蛋白的表达变化。结果转染Let-7b mimic 的 GH3细胞中CD147、MMP-9的表达在mRNA水平及蛋白都明显低于对照实验组；相反,转染AMO的GH3细胞中CD 147、MMP-9的表达在mRNA及蛋白水平都明显高于对照实验组(P<0.05)。并且CD147、MMP-9的表达与Let-7b的表达呈负相关(P<0.05)；其中CD147的表达与MMP-9的表达呈正相关(P<0.05)。结论通过慢病毒为载体的Let-7b转染GH3细胞对CD147、MMP-9在mRNA水平及蛋白水平都起到明显的抑制作用。并对细胞的功能产生重要的影响。目前已经证实：CD147可以通过促进基质金属蛋白酶-9的表达对肿瘤细胞的侵袭性等生物学行为起到明显的促进作用。在本次的实验研究中,本课题组以大鼠垂体腺瘤GH3细胞为研究对象,体外构建碱基序列,利用慢病毒为载体,侵袭转染以改变GH3细胞中Let-7b的表达水平,通过后续实验方法检测与肿瘤侵袭性密切相关的蛋白CD147、MMP-9表达量变化及细胞的侵袭能力,从而达到明确Let-7b对垂体腺瘤GH3细胞侵袭性生长作用的目的。本实验分为两部分。I MicroRNALet-7b靶向CD147对大鼠垂体腺瘤GH3细胞CD147.MMP-9表达的影响目的讨论Let-7b对大鼠垂体腺瘤GH3细胞CD 147、MMP-9表达的调控作用。方法大鼠GH3细胞株体外培养并进行慢病毒转染,分别转染Let-7b mimic、反义寡核苷酸链(AMO)及空白病毒作为对照组。转染72h后,分别应用RT-PCR检测Let-7b、CD147、MMP-9 mRNA表达量的变化,Western blotting检测CD147、MMP-9蛋白的表达变化。结果转染Let-7b mimic 的 GH3细胞中CD147、MMP-9的表达在mRNA水平及蛋白都明显低于对照实验组；相反,转染AMO的GH3细胞中CD 147、MMP-9的表达在mRNA及蛋白水平都明显高于对照实验组(P<0.05)。并且CD147、MMP-9的表达与Let-7b的表达呈负相关(P<0.05)；其中CD147的表达与MMP-9的表达呈正相关(P<0.05)。结论通过慢病毒为载体的Let-7b转染GH3细胞对CD147、MMP-9在mRNA水平及蛋白水平都起到明显的抑制作用。Ⅱ MicroRNALet-7b对大鼠垂体腺瘤GH3细胞侵袭性的影响目的探讨Let-7b对大鼠垂体腺瘤GH3细胞侵袭性生物学行为的影响。方法：体外培养GH3细胞株并进行慢病毒转染,分别转染Let-7b模拟物(Let-7bmimic)、反义寡核苷酸链(AMO)、以及利用不含与大鼠同源碱基序列的空白病毒作为实验对照组。继续培养细胞,在转染载体病毒后36h、48h、60h、72h通过Transwell小室实验检测GH3细胞侵袭能力的改变。结果； 利用慢病毒转染大鼠GH3细胞后实验结果显示：自然生长组(83个/视野)与空白对照组(79个/视野)差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组比较Let-7b mimic组(42个/视野)、Let-7b AMO组(125个/视野)差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过采用慢病毒侵袭转染GH3,上调细胞中Let-7b表达量可以较为明显的抑制大鼠垂体腺瘤GH3细胞侵袭性生长的能力。