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研究目的: 研究CD133分子促进胃癌细胞化疗多药耐药能力的分子机制，明确CD133是否通过其胞内段酪氨酸残基与 PI3Kp85相互作用介导其多药耐药的产生及其作用位点。 研究方法: 1.通过慢病毒包装技术，构建稳定干扰 CD133表达的KATOIII胃癌细胞系及稳定过表达CD133的MKN45胃癌细胞系，荧光显微镜下观察慢病毒的转染效率，Western blot与qPCR法验证CD133的过表达及干扰效率。CCK-8法检测各组细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）的敏感性，Western blot法和qPCR法检测不同胃癌细胞P-gp、Bax、Bcl-2的表达水平。 2.在干扰及过表达CD133后，Western blot检测各组细胞p-Akt及Akt表达；ELISA检测PI3K酶活性。分别使用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002与激活剂EGF处理KATOIII与MKN45细胞，CCK-8法检测各组细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）的敏感性，Western blot法检测不同胃癌细胞P-gp、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt的表达水平，ELISA法检测PI3K酶活性。 3.通过基因定点突变的方法构建CD133胞内段五个酪氨酸残基（818，819，828，846，852）的突变质粒，分别转染MKN45细胞后，CCK-8法检测对5-FU和DDP的敏感性，ELISA法与Western blot法检测PI3K活性，GST-pull down法验证其与PI3K-p85之间的相互作用。 研究结果: 1.通过荧光显微镜观察、蛋白及mRNA检测，CD133干扰及过表达细胞系成功构建。shRNA干扰CD133表达后，KATOIII细胞对化疗药物5-FU及DDP的敏感性明显升高；而CD133过表达后,MKN45细胞对5-FU及DDP的敏感性则明显降低。干扰 CD133表达能够降低 P-gp，Bcl-2的蛋白及 mRNA表达，而升高Bax蛋白及mRNA水平；与之相反，CD133过表达则能够升高P-gp,Bcl-2蛋白及mRNA表达，而降低Bax蛋白及mRNA水平。 2．干扰CD133表达，KATOIII细胞p-Akt蛋白水平及PI3K酶活性明显下降；而 CD133过表达则明显升高 MKN45细胞的p-Akt蛋白表达和 PI3K酶活性。PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002明显升高KATOIII细胞对5-FU及DDP的敏感性，同时P-gp及Bcl-2蛋白水平明显下降，Bax蛋白明显升高，而p-Akt和PI3K酶活性也明显下降；而激活剂EGF则明显降低MKN45细胞对5-FU及DDP的敏感性，同时P-gp及Bcl-2蛋白水平明显升高，Bax蛋白明显降低，而p-Akt和PI3K酶活性则明显升高。 3.通过基因定点突变的方法构建CD133羧基端酪氨酸突变质粒（分为位于818，819，828，846，852），分别转染MKN45细胞（分为vector，wide type，818，819，828，846，852七组），CD133野生型及818、819、828、846位酪氨酸突变组对5-FU及DDP的敏感性均显著低于对照组，而852突变组则无明显差异。同时，除852组外，其他组p-Akt蛋白水平及PI3K酶活性均明显高于对照组。最后通过构建GST-p85融合蛋白，使用谷光苷肽巯基转移酶沉淀试验（即gst pull-down），结果显示852组CD133蛋白与p85之间的结合与其他组相比明显降低。 研究结论: CD133能够通过其852位酪氨酸与PI3Kp85相互作用调节PI3K/Akt/信号通路，进而促进胃癌细胞的化疗多药耐药能力。