论文部分内容阅读
胚胎期造血系统的发育可分为两个阶段：原始造血阶段和永久造血阶段。在胚胎首先出现的造血为原始造血(primitivehematopoiesis)，位于胚外卵黄囊中央血岛，仅产生原始有核红细胞和巨核细胞，无法产生脾集落形成单位和长期重建造血的造血干细胞(long-termrepopulatinghematopoieticstemcells，LTR-HSCs)；能产生LTR-HSC、为胚胎大部分时期的发育提供造血物质、为生后造血系统提供HSCs储备池的永久造血稍后发生。原始造血发生于卵黄囊血岛已被普遍认可，但永久造血的起源部位尚存争议。长期以来认为永久造血也是起源于胚外卵黄囊，而近10年来越来越多的证据表明永久造血起源于胚内的主动脉旁胚脏壁(paraaorticsplanchnopleura，PAS)/主动脉-性腺-中肾区(aorta-gonad-mesonephrosregion，AGMregion)。AGM区正成为国际上造血发生发育机制、造血分化机制研究中的热点。
由于永久HSC在AGM区存留时间短、数目极为有限，加之胚体幼小、取材困难，有关研究还十分有限。MarcosMA等报道小鼠AGM区细胞表达c-kit，AA4.1，Mac-1和Sca-1，但未对这类细胞的造血活性进一步研究。DelassusS等分离孕11天小鼠的AGM单个细胞，发现AGM区CD34+ckit+细胞具有多系造血形成能力；RT-PCR和基因分析发现AGM区CD34+ckit+细胞表达红系(β-globin)和髓系(MPO)标志，不表达淋巴系标志CD3、Thy-1和λ5，多数细胞还表达干细胞相关基因标记如AML-1、PU.1、GATA2和Lmo2以及造血生长因子受体G-CSF-R。人AGM区HSCs的表型迄今未有定论，也缺乏其基因表达的研究。
永久造血的发育受到两方面因素的调控，即造血微环境及遗传基因。AGM区细胞和脂肪细胞。
1.胎肝基质细胞和胎肝MSC表面标记的检测
流式细胞仪检测结果显示内皮细胞或造血细胞抗原CD31、CD34、CD45在二者表面为阴性表达，而CD29、CD44、CD105、CD106、CD166均为阳性表达；与GVHD发生相关的标记HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40、CD40L均为阴性。间接免疫荧光检测结果显示人FL基质细胞和MSC表达细胞外基质蛋白Fibronectin、α-SMA，同时表达发育中的FL细胞即上皮细胞的标记AFP和E-cadherin。
2.造血相关基因和造血生长因子mRNA的表达
FL基质细胞的RT-PCR检测结果显示人FL基质细胞表达造血相关基因GATA-2mRNA，表达gp130、BMP-4、TGF-β1mRNA，表达IL-3、IL-6、SCF、FLT-3L、OSM、EPO等造血生长因子mRNA，不表达TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。FL-MSC除不表达造血因子IL-3mRNA外，其他表达情况与基质细胞表达情况相同。
3.ELISA检测胎肝基质细胞和胎肝MSC培养上清中造血因子水平
FL基质细胞和MSC均分泌造血生长因子BMP4、TGF-β1、EPO和IL-6，且因子水平高于胎龄35天YS来源基质细胞和躯干成纤维细胞(P＜0.05)。二者P5代细胞分泌因子的水平基本无显著差异，而在P0、P10、P15代以基质细胞分泌水平较高，其中各代FL基质细胞EPO分泌水平始终高于FL-MSC。
4.小结本研究分离培养FL造血期FL基质细胞和MSC。结果显示，人FL基质细胞和MSC表达造血微环境细胞外基质蛋白Fibronectin、α-SMA，同时表达发育中的胎肝细胞即上皮细胞的标记AFP和E-cadherin，提示二者对胎肝造血期造血和肝脏发育具有重要意义。RT-PCR和ELISA检测到胎肝基质细胞表达多种造血生长因子，有作用于中胚层调节造血细胞形成的BMP4和TGF-β1，有作用于早期HSC和造血祖细胞的HGFs(IL-3、IL-6、SCF、FLT-3L)，尚有作用于红系的EPO表达。与FL-MSC相比，同一组织来源的胎肝基质细胞表达更多的造血因子，是胎肝造血期主要的造血微环境成分；胎肝MSC分化能力更强，可能处于发育生物学的上游阶段，它即能分化产生VSMC形成造血基质成分促进造血，又能进一步分化为成熟肝细胞，对造血和肝脏发育都具有不可或缺的作用。