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背景：
神经病理性疼痛是一种由中枢或外周神经病变或功能障碍引起的疼痛综合征，严重影响病人的生活质量。背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)神经元是初级感觉神经元，负责将外界疼痛刺激转换为内在神经冲动并将其传导至脊髓。目前针对周围性神经病理性疼痛的一些研究集中在DRG神经元的瞬时感受器电位离子通道家族(Transient receptor potential channel，TRP channel)及其功能上。作为TRP通道家族成员之一，瞬时感受器电位离子通道-香草素亚型4(Transient receptor potential vanilloid4，TRPV4，also known aS OTRPC4，VRL-2，VR-OAC，and TRP12)是一种非选择性阳离子通道，具有Ca2+子通透性，参与DRG神经元介导的疼痛信号传导过程。Alessandri-Haber等发现沉默TRPV4通道蛋白会导致细胞渗透压调节异常及对低渗性伤害性刺激反应能力下降。此外，TRPV4在炎性物质导致的DRG机械痛觉过敏过程中起重要作用。在长春新碱、酒精中毒、糖尿病及人类免疫缺陷病毒等因素导致的外周神经病变动物疼痛模型中，注射TRPV4反义寡核苷酸会使动物的机械痛觉过敏降低。因此，了解DRG神经元TRPV4通道活动的分子机制对进一步理解疼痛发生发展有重要帮助。然而目前该分子机制，尤其是调节TRPV4表达及功能的机制，还并不完全清楚。
研究表明某些细胞上TRPV4的基因表达和功能变化受一些辅助蛋白的调节，如神经元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物3(protein kinase C and casein kinasesubstrate in neurons protein3，PACSIN3)、三磷酸肌醇(1，4，5)受体3(inositol1，4，5-trisphosphate receptor type3，IP3R3)及肌动蛋白，但DRG神经元TRPV4受何种因素调节还未有确切的理解。动物DRG的慢性压迫(chronic compression ofDRG，CCD)可以模拟临床上椎管狭窄和椎间盘突出等疾病引起的神经根受压症状，是一种典型的神经病理性疼痛模型。我们前期的研究显示TRPV4参与介导CCD诱导的机械痛及热痛觉过敏。进一步的蛋白质组学分析发现CCD会导致15种蛋白的表达变化，膜联蛋白A2(Annexin A2)作为其中的一种蛋白其表达显著上调。膜联蛋白家族(Annexins)是一类主要分布在细胞膜胞质面的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，并在许多生理过程中发挥重要作用包括离子通道的调节。研究证实Annexin A2通过与TRPV5/V6形成功能性复合物而参与TRPV5/V6的膜转运。然而，AnnexinA2是否能够与TRPV4相互作用并修饰其功能和或表达尚未报道。
在本实验中，我们利用免疫细胞化学和免疫共沉淀技术研究DRG神经元Annexin A2和TRPV4两蛋白间的相互作用。通过实时定量逆转录聚合酶链反应(real time reverse transcription-polymerase chain reaction，Real Time RT-PCR)、蛋白免疫印迹法及Ca2+荧光成像技术进一步研究Annexin A2对TRPV4功能及表达方面的调节作用。
目的：
研究膜联蛋白A2对大鼠DRG神经元TRPV4的调控。
方法：
1.DRG神经元培养
取新生1天Wistar大乳鼠L2-L6的DRG，1mg/ml的胶原酶与0.25％的胰酶37℃水浴箱消化50分钟，加入10％血清终止消化。应用吸管轻柔反复吹打至细胞悬液。200目滤网过滤去除未分散的组织块。在含2％B27和1％神经生长因子(NGF)的NeurobaSal基础培养液中培养。每2天更换培养基1次，培养第4天的DRG神经元用于后续实验。
2.免疫细胞化学
DRG神经元培养4天后，冷丙酮-20℃固定细胞10分钟，加入2％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)室温封闭1小时，TRPV4(5ug/ml)与AnnexinA2(20ug/ml)一抗4℃孵育过夜。次日，加入带有荧光标记的相应二抗室温孵育1小时。细胞核使用DAPI染色2分钟。封片，荧光显微镜下观察TRPV4与Annexin A2在DRG神经元的定位区域。
3.免疫共沉淀
收集DRG神经元，加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)冰上裂解30分钟。4℃14000g离心10分钟，转移上清(总蛋白)至新EP管。总蛋白中加入ProteinA+G agarose，4℃摇晃30分钟以去除非特异性杂蛋白。4℃14000g离心10分钟，转移上清至新EP管以去除ProteinA+G agarose。总蛋白中加入抗体4℃水平缓慢摇晃孵育过夜。次日加入ProteinA+G agarose，4℃水平缓慢摇晃孵育2小时。4℃3000g离心5分钟，将proteinA+G agarose离心至管底。去掉上清，收集管底agarose-抗原抗体复合物，预冷PBS洗5遍。加入上样缓冲液重悬agarose-抗原抗体复合物，95℃煮沸5分钟以游离抗体、琼脂糖珠及蛋白。Western blot分析。
4.AnnexinA2 siRNA干扰
将DRG神经元以1×105/ml的密度接种在96孔板上，培养4天后加入100nmol/L的Accell Annexin A2 siRNA l ul+97ul Accell delivery media+2％B272ul，培养72小时后提取RNA与蛋白检测Annexin A2及TRPV4mRNA及蛋白表达情况以检验Annexin A2对TRPV4表达的调节作用，同时进行细胞内[Ca2+]i的测量以观察Annexin A2对TRPV4的功能调节作用。
5.实时定量RT-PCR检测
从各组DRG神经元中提取RNA，实时定量RT-PCR检测Annexin A2及TRPV4 mRNA表达的变化。
6.Western blotting检测
从各组DRG神经元中提取蛋白质，Western blotting检测Annexin A2及TRPV4蛋白表达的变化。
7.Ca2+成像实验
Ca2+荧光探针(Fluo-3/acetoxymethyl ester，Fluo-3/AM)从-20℃冰箱中取出，室温下复温，应用含有0.02％pluronicF127的等渗溶液将其配制成终浓度5umol/L。DRG神经元PBS冲洗1次后加入Fluo-3/AM，室温下负载30分钟，负载过程中可轻轻摇晃促进染色，然后PBS冲洗2次。将孵育完的DRG神经元放在LCSM的载物台上，488nm激光激发Fluo-3，观察细胞内Ca2+荧光强度的变化。实验应在室温下(<24℃)进行，且在给予药物刺激之前，应先测量细胞内Ca2+荧光强度至少30秒作为基础值。然后应用TRPV4的激活剂4a-phorbol12，13-didecanoate(4α-PDD，10umol/L)刺激3分钟，观察施加药物前后荧光强度变化。
结果：
1.免疫荧光检测Annexin A2与TPRV4在DRG神经元的定位区域
Annexin A2与TRPV4在DRG神经元存在部分共定位区域包括细胞膜及细胞质。
2.免疫共沉淀检测Annexin A2与TPRV4间的相互作用
提取的DRG神经元总蛋白，经anti-TRPV4抗体和proteinA+G agarose共沉淀后，用anti-Annexin A2抗体行western blot可检测到沉淀蛋白中的Annexin-A2(39kD)；经anti-AnnexinA2抗体和proteinA+G agarose共沉淀后，用anti-TRPV4抗体行western blot能检测到沉淀蛋白中的TRPV4(98kD)。上述结果提示Annexin A2与TRPV4通道蛋白之间存在某种关联。
3.RT-PCR测量干扰Annexin A2后AnnexinA2及TRPV4的mRNA变化
AnnexinA2：干扰AnnexinA2之后，干扰组AnnexinA2的mRNA表达降低，与正常对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。
TRPV4：干扰Annexin A2之后，干扰组TRPV4的mRNA表达降低，但与正常对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。
4.Western blot测量干扰AnnexinA2后AnnexinA2及TRPV4的蛋白变化
AnnexinA2：干扰AnnexinA2之后，干扰组AnnexinA2的蛋白表达降低，与正常对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。
TRPV4：干扰AnnexinA2之后，干扰组TRPV4的蛋白表达降低，但与正常对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。
5.AnnexinA2的下调对TRPV4介导的Ca2+内流的影响
与对照组比较，干扰AnnexinA2可以明显降低DRG神经元内4α-PDD诱导的TRPV4介导的Ca2+内流(P<0.05)，但Ca2+内流并没有完全消失。
结论：
Annexin A2对大鼠DRG神经元TRPV4的功能具有调节作用。