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目的:建立胶滴肿瘤体外药敏检测技术,并将其应用于肿瘤的中药单体实验研究中。评价三氧化二砷和粉防己碱对乳腺癌MCF-7细胞的作用效果,为三氧化二砷和粉防己碱的临床应用奠定理论基础。
方法:
1.肿瘤细胞悬液制备:将乳腺癌MCF-7细胞传代,待细胞生长状态良好时,置于50ml离心管中,加入10ml组织消化酶,于37℃培养箱中,消化2-3小时。消化完毕后,通过16目的筛网过滤,获得单细胞悬液。
2.肿瘤细胞的原代单层培养:将上述细胞悬液加入到I型胶原蛋白包被的细胞培养瓶中培养24小时,弃上清中未贴壁的死细胞。
3.胶原蛋白凝胶内培养:将细胞用胶原酶消化后,收集活细胞并计数,调整到细胞浓度为1×105个/ml。在冰浴的条件下,将胶原蛋白-细胞混合溶液接种于6孔细胞培养板,每孔均接种3滴(30μl/滴),接种量为3000个细胞/滴,将培养板置于细胞培养箱内1小时以形成胶滴。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,进行培养。
4.待测药物的添加:细胞培养板置于5%CO237℃细胞培养箱内培养24小时后,分为三氧化二砷组、粉防己碱组、三氧化二砷+粉防己碱组、空白组,在培养板中分别加入不同浓度三氧化二砷组、粉防己碱组、三氧化二砷和粉防己碱,同时设不加药阴性对照孔。培养24小时后清洗除去药物后,无血清培养7天。
5.结果测定:中性红染色固定、扫描,结果传输计算机。利用图像软件分析药物的抑制率,评估药物体外杀伤作用。
6.结果评价:通过图像软件,对图像进行分析。对亮度值在0-128之间的肿瘤细胞形成的克隆进行光密度的计算(OD),结果传输到计算机,计算出分析药物的抑制率。
OD=log10(投射光总量/透射光总量)
药物体外敏感性用T/C的百分比值表示,其中T为加药处理组的光密度值,C为空白对照组光密度值。如果T/C的百分比值≤50%则认为药物在体外敏感。根据药物对乳腺癌MCF-7细胞的作用分别分为敏感(S)和耐药(R)。
结果:成功建立了胶滴肿瘤药敏检测技术,明确了三氧化二砷和粉防己碱对肿瘤细胞的抑制率,并确定了胶滴肿瘤体外药敏检测技术的可靠性。
结论:国内外研究结果表明胶滴肿瘤药敏检测技术检测的标本可评价率高,检测结果与临床研究相关性好。本课题将胶滴肿瘤药敏检测技术用于中药单体的研究,评价了中药单体杀伤肿瘤细胞的有效性,对抗肿瘤中药的筛选以及为乳腺癌的中药治疗奠定理论依据。且采用国内已经广泛使用于细胞学实验的四甲基偶氮唑盐比色法验证实验结果,验证胶滴肿瘤药敏检测技术在中药研究中的可行性。