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膀胱癌(Bladder cancer)是人类泌尿系统常见的恶性肿瘤,其中绝大部分为尿路上皮癌(Bladder urothelial carcinoma)。随着膀胱肿瘤电切、膀胱癌根治技术的不断普及和提高,膀胱癌的治疗效果得到了不断的改善;但是,初发膀胱癌经正规治疗后,仍容易复发和进展,甚至导致死亡,因而,膀胱癌的治疗仍然是一个世界性的难题。本实验通过探讨YAP1促进膀胱癌细胞上皮-间质转化的相关分子机制,将有助于临床上寻找防治膀胱癌浸润、转移的方法和策略,为膀胱癌的治疗提供新的思路;为将来实现膀胱癌的分子靶向治疗,提供新的治疗靶点。第一章膀胱癌组织、细胞株中YAP1、E-cadherin和Vimentin的表达及其临床意义目的:检测膀胱癌细胞株、膀胱癌组织和癌旁组织中YAP1、E-cadherin和Vimentin的表达水平,并分析三者表达的相关性,以及YAP1、E-cadherin的表达与膀胱癌病理分级、分期、预后之间的关系。方法:收集18例膀胱癌组织及癌旁粘膜组织,用荧光定量PCR法检测YAP 1、E-cadherin、Vimentin表达。IHC法检测55例膀胱癌组织(组织芯片)、10例癌旁粘膜组织(组织芯片)中YAP1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达的差异。并统计分析三者的表达与病理分级、分期之间的关系,以及YAP1、E-cadherin表达与膀胱癌预后之间的关系。RT-qPCR、Western-blot法检测膀胱癌细胞株T24、UMUC3及正常膀胱粘膜细胞中YAP1、E-cadherin、Vimentin表达的差异。结果:55例膀胱癌组织的免疫组化检测发现癌组织中YAP1和Vimentin表达升高,E-cadherin表达降低;且高级别癌组织中的YAP1表达高于低级别组;肌层浸润性膀胱癌组中的YAP1表达高于非肌层浸润性膀胱癌组;生存分析发现YAP1高表达组、E-cadherin低表达组的总体生存率均分别低于YAP1低表达组、E-cadherin高表达组。相关性分析发现YAP1的表达与E-cadherin的表达成负相关,与Vimentin的表达成正相关。同时荧光定量PCR检测也发现18例膀胱癌组织中YAP1、Vimentin表达高于癌旁组织,而E-cadherin的表达低于癌旁组织。膀胱癌细胞中三者的表达与膀胱癌组织结果相符。结论:YAP1在膀胱癌组织、膀胱癌细胞株中高表达,与E-cadherin的表达成负相关,与Vimentin的表达成正相关,与膀胱癌组织的恶性程度、分期密切相关,并且YAP1高表达提示更差的预后。第二章YAP1对人膀胱癌细胞侵袭功能及EMT的影响目的:通过siRNA干扰技术下调膀胱癌细胞中YAP1的表达,研究YAP1对细胞侵袭功能、EMT的影响。方法:采用YAP1 siRNA转染人膀胱癌细胞株UMUC3和T24,下调YAP1表达;然后利用Transwell法检测YAP1被抑制后对细胞侵袭能力的影响;RTqPCR 和 Western blot 法检测 EMT 相关蛋白 E-cadherin、Vimentin 的表达。结果:下调膀胱癌细胞YAP1的表达后,细胞的侵袭能力受到显著抑制。下调YAP1后EMT标志蛋白Vimentin表达下降,E-cadherin表达升高。RTqPCR结果与其一致。结论:下调YAP1表达可以逆转人膀胱癌细胞的EMT并降低其侵袭能力。第三章YAP1促进人膀胱癌细胞EMT的相关机制以及E-cadherin的反馈作用目的:探讨YAP1对UMUC3和T24细胞EMT上游调节蛋白ZEB1、Snail1表达的影响,探讨YAP1在膀胱癌细胞中促进EMT的内在机制,以及E-cadherin表达下调后对YAP1、EMT相关蛋白的反馈作用。方法:YAP1-siRNA、E-cadherin-siRNA分别转染人膀胱癌细胞株UMUC3和T24细胞下调YAP1或E-cadherin表达。检测下调YAP1表达对Snail1、ZEB1、p-AKT 表达的影响;检测下调 E-cadherin 表达对 YAP1、Vimentin、ZEB1、Snail表达的影响。应用pcDNA-YAP1转染T24、UMUC3细胞过表达YAP1,检测EMT相关蛋白及p-AKT蛋白表达,并应用Ipatasertib抑制AKT后检测EMT相关蛋白表达。结果:干扰YAP1后Snail1、ZEB1、p-AKT表达下调,干扰E-cadherin后YAP1、ZEB1、Snail1与Vimentin表达上调。YAP1过表达后p-AKT表达上调,EMT相关蛋白Vimentin、ZEB1、Snail1表达上调,E-cadherin表达下调;且这种影响可被AKT抑制剂部分抑制。结论:YAP1可通过AKT信号通路促进膀胱癌细胞EMT,E-cadherin可反馈作用于YAP1及EMT相关蛋白,使后两者表达上调。