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猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养殖业造成了巨大的经济损失。该病急性以肺部广泛出血为特征，慢性以肺部局灶性坏死和胸膜炎由为特征。由Pattison等于1957年首次报道，目前遍及世界各地。免疫接种是预防和控制该病的主要措施，目前我国用于预防PCP的主要疫苗是灭活疫苗。这种灭活疫苗对于同种血清型的感染可降低死亡率，但不能降低发病率和慢性感染，不能阻止肿部病变，更不能对异型菌提供交叉保护，临床上迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。通过对胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究，证实分泌毒素为其最重要的毒力因子，同时也是其最重要的免疫原性因子，加有类毒素的灭活疫苗保护力大为提高。鉴于此，本研究开展了APP类毒素菌苗的研究，旨在提高灭活疫苗的保护效力。主要研究内容包括： 1．APP7型菌生长曲线的测定 通过对比国内外培养胸膜肺炎放线杆菌常用的三种培养基，发现胰蛋白酶大豆汤（TSB）最有利于APP的培养。利用浊度测定和细菌计数对APP 7型菌在TSB中的生长周期进行测定，发现其在7h～10h进入稳定期，世代间隔约为30min。而且，APP 7型菌在TSB中的生长具有明显的对数生长期（1h-4h），在对数生长期其浊度和活菌量具有对应关系，可用于APP的攻毒试验。 2．Apx Ⅰ结构基因在大肠杆菌中的高效表达 根据Apx Ⅰ的结构特点，我们构建了原核表达Apx Ⅰ的质粒pET-Ⅰ CA和pET-Ⅰ A，在IPTG诱导下两种质粒均获得高效表达，表达的融合蛋白分子量均为110kDa，主要以包涵体形式存在。其中质粒pET-Ⅰ CA表达的Apx Ⅰ具有很好的溶血活性，Western blot检测证实表达产物具有良好的反应原性。 3．Apx Ⅰ表达产物免疫原性的研究 将大肠杆菌中表达的包涵体进行纯化与复性，和等量弗氏不完全佐剂乳化后免疫小鼠，同时免疫的还有天然毒素作和不经过纯化与复性的粗提包涵体。用APP 10型10×LD50进行攻毒的结果显示，经过复性的表达产物和粗提包涵体都具有良好的免疫原性，可以取代天然毒素作为疫苗的添加成分。 4．基因工程类毒素菌苗对小鼠的保护效力研究 利用Apx Ⅰ、Apx Ⅱ和Apx Ⅲ的表达产物和我国最为流行的7型菌，和等量弗氏不完全佐剂乳化后制成类毒素菌苗免疫小鼠。利用天然毒素建立三种毒素的ELISA检测方法，对小鼠抗体的检测发现，二次免疫后三种毒素的抗体效价均显著升高。用5×LD50的1型菌和7型菌进行攻毒，免疫小鼠对1型菌的保护力为83.3华中农业大学博士学位论文%（10/l2），对7型菌的保护力为91.7%（11/12）。小鼠攻毒结果初步显示类毒素菌苗对于同型菌和异型菌都有很好的的保护效果，显示了良好的应用前景。5.类毒素菌苗对仔猪的效力研究 利用Apxl、ApxH和Apxln的表达产物和我国最为流行的7型菌，混合后和油佐剂乳化制成类毒素菌苗，间隔三周两次免疫断奶仔猪，同时设三价细菌灭活苗组和空白对照组。利用EUSA检测三种毒素的抗体，利用间接血凝检测7型菌抗体。二次免疫两周后用3.2xl夕cFu的APPI型进行气管攻毒。类毒素菌苗组具有较高的毒素抗体和间接血凝抗体，但三价细菌灭活苗只有间接血凝抗体。类毒素菌苗组攻毒后基本没有表现出临床症状，剖检肺部病变轻微;三价细菌灭活苗组攻毒后体温升高，剖检肺部病变明显;空白对照组临床症状明显，剖检呈现典型的胸膜肺炎病变。抗体检测和攻毒结果显示类毒素菌苗对于强毒APP的感染保护效果优于三价细菌灭活苗，能显著降低临床发病，减轻肺部病变，可以取代细菌灭活苗用于胸膜肺炎的免疫预防。攻毒结果还显示毒素抗体和保护力呈正相关。