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犊牦牛(Bos grunniens)腹泻是目前牧区常发疾病,主要由致病性大肠杆菌(Enterotoxigenic,E.coli)所引起,严重危害牧区畜牧业的健康发展。在牧区,基层兽医人员及相关医疗器械缺乏,同时牦牛的野性较大,静脉滴注、补液等常规手法无法在牧区开展推广。通常情况下,牧民不易掌握静脉注射、肌注和灌胃等操作,像针剂、粉剂等需要辅助器械给药不方便,由此产生的不合理的操作均会对牦牛有较大的应激反应,且对牧民带来巨大的安全隐患。因此,在牧区牦牛生产应用中,人们迫切希望研制一种适口性好、使用方便的口服凝胶药物制剂。以减少动物应激,便于牧民操作,满足“无针”的动物福利要求,为犊牦牛腹泻基本的治疗提供便利。本研究对分离于川西北高原地区腹泻犊牦牛E.coli进行药敏实验,调查其耐药谱;以此为基础,筛选出耐药率低、敏感性高的氨基糖苷类药物硫酸庆大霉素(Gentamicin,GN),并对氨基糖苷类修饰酶(AMEs)耐药基因进行检测。同时,设计并研制凝胶药物基质,分别以可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)、甘油及吐温-80四者为主要辅料,以单因素摸索各成分用量的大致范围,并对这四因素进行L9(34)正交设计。以凝胶外观、性状、黏度等方面综合优化筛选配方,制备硫酸庆大霉素口服凝胶剂,并进行初步的质量研究。同时,对本试验所研制的硫酸庆大霉素凝胶剂进行大鼠安全性试验,开展犊牦牛临床研究;为口服凝胶药物制剂在牧区牦牛生产上的应用提供理论依据。结果和结论如下:1.犊牦牛源E.coli耐药性本研究采用K-B药敏片法对41株腹泻犊牦牛源E.coli进行7大类21种药物的敏感测定。药敏试验显示,氨基糖苷类药物新霉素、庆大霉素、丁胺卡那和卡那霉素敏感率均在70%以上,分别为80.49%、82.93%、92.68及70.73%,同时丁胺卡那敏感率最高,新霉素无耐药菌株。喹诺酮类药物敏感性稍低。β内酰胺类药物敏感性不一,青霉素类敏感性均低于50%,头孢拉定敏感性最低仅有2.44%。四环素类药物耐药率均高于50%,其余药物的敏感性也存在差异,复方新诺明为51.1%,而多黏菌素B为87.8%且不存在耐药表现。41株E.coli中,有60.97%出现多重耐药情况,其中最高为17耐;有21.95%菌株对全部21种药物均敏感。所有耐药谱在10耐及其以上的菌株都对喹诺酮类、四环素类和β内酰胺青霉素类表现耐药。本研究说明红原地区牦牛源大肠杆菌出现了一定的多重耐药及交叉耐药情况,为当地牧区科学合理用药提供了参考。2.E.coli氨基糖苷类修饰酶耐药基因检测与分析在对41株牦牛源E.coli进行三大类氨基糖苷类修饰酶7种耐药基因(ant(4’)-Ia、aad B、aph(3’)-III、aph(3’)-IIa C、aac(3)-II、aac(6)-Im、aaac(6’)-Ie-aph(2’)-I)检测及测序。试验发现有氨基糖苷乙酰转移酶(AAC)、氨基糖苷磷酸转移酶(APH)及双功能酶aaac(6’)-Ie-aph(2’)-I耐药基因的存在,未检测到氨基糖苷类核苷转移酶(ANT)耐药基因。其中aac(3)-II、aph(3’)-III、aaac(6’)-Ie-aph(2’)-Ia的检出率分别为100%,17.07%(7/41)和80.48%(33/41)。对aac(3)-II及aph(3’)-III进行测序,并在NCBI中比对分析,未比对到其余的大肠杆菌有这两种耐药基因序列。基因库中,与aac(3)-II99%同源性的只有一株肺炎伯雷克菌(Klebsiella Pneumoniae);所测的aph(3’)-III序列同源性均为99%,分属于肠球菌属、链球菌、弯曲杆菌、鸡杆菌属等14条序列,未比对到其他来源的大肠杆菌。试验显示,氨基糖苷类耐药基因与其耐药表型符合率不高,且存在于不耐药菌株中。本次试验首次测定了牦牛源大肠杆菌相关AMEs耐药基因。3.硫酸庆大霉素口服凝胶剂的研制选择甘油、可溶性淀粉、CMC-Na和Tween-80作为凝胶剂主要基质成分,按预试验所得结果将每种组份设3个浓度梯度,设计L9(34)正交试验配置9组样品。通过对凝胶黏度、外观及性状的等性质综合判断优化筛选配方。最佳处方配比为20%甘油、15%可溶性淀粉、0.9%CMC-Na和0.2%Tween-80,并在制剂中加入适量山梨酸钾、食盐及可食用奶味香精,用灭菌水补足至100g。采用抗生素微生物检定法测定硫酸庆大霉素含量,其日内、日间RSD小于3%,样品回收率在97%以上,说明测定方法精确可行。硫酸庆大霉素口服凝胶制备简单,优选配方产品外观细腻富有芳香,黏度适中;虽在不同温度及湿度条件下保存后外观性状略有变化,但主药含量均保持稳定保持在95%以上。长期在室温15℃下保存放置,其含量及相关性状稳定。说明本试验方法制备的硫酸庆大霉素凝胶制剂方法简便可行。4.凝胶剂的安全性试验及临床应用用4周龄体重为180-210g SD大鼠进行硫酸庆大霉素口服凝胶剂安全性试验,设高、中、低三个不同剂量组和一个对照组,剂量分别为48 mg/kg、24 mg/kg、12 mg/kg,早晚(8am.,9pm.)固定时间持续灌胃给药15天。中、低两组大鼠体重增加值分别为22.67g和23.33g,略低于正常组的38.0g,但无显著差异(P﹥0.05);高剂量组体重增长值为6g显著低于正常组(P﹤0.05),试验后期肾功能指标BUN和CRE显著升高(P﹤0.05);所有大鼠试验后脏器系数正常,其余各组各项血清生化指标正常。说明犊牦牛临床推荐剂量的硫酸庆大霉素口服凝胶剂在大鼠上连续饲喂是安全的。用硫酸庆大霉素口服凝胶止泻剂(8mg/kg)对腹泻犊牦牛进行治疗,早晚各一次连续治疗三天并观察一周,其有效率为87.50%,治愈率为75.00%,使用方便,与针剂的76.9%治愈率无显著差异(P﹥0.05)。腹泻犊牦牛和正常犊牛间血清生化指标存在着差异,腹泻组血清Ca2+、P、Cl-、Na+、TP、ALB含量及ALP、ALT、AST酶活性显著低于正常犊牛(P﹤0.05),Mg2+、CRE差异不显著(P﹥0.05)。治疗后,Ca2+和ALB含量恢复正常,其余指标均逐步恢复。正常对照犊牦牛服用相同剂量凝胶剂后,没有不良症状表现,血清生化指标无显著变化(P﹥0.05)。说明以8mg/Kg硫酸庆大霉素口服凝胶止泻剂运用犊牦牛安全有效。