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研究背景和目的结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一。目前手术联合化疗及放疗是最主要的治疗手段,但近几十年来,5年生存率仍未见明显提高。结直肠癌患者最主要的死亡原因是术后局部复发和远处转移。国内外的众多研究表明结直肠癌患者外周血、骨髓、淋巴结中存在的肿瘤细胞是患者局部复发和远处转移的重要因素,是判断预后的重要指标,是全身性辅助治疗的指征之一,因此检测结直肠癌患者外周血、骨髓等其中的循环肿瘤细胞具有重要的临床意义。最早使用普通细胞学方法检测外周静脉血液或骨髓中转移的肿瘤细胞,然而这些方法需在有大量癌细胞聚集时才能诊断出来,所以其敏感性都非常低。随着分子生物学及细胞生物学的迅速进步,PCR及RT-PCR技术的诞生,各种肿瘤标志物的不断发现,使得循环肿瘤细胞的检测成为可能,近年来,运用RT-PCR及其各种改进方法检测肿瘤标志物的mRNA成为最主要的检测结直肠循环肿瘤细胞的方法。这些方法的敏感度远远高于常规方法。然而不同研究小组的结果差异极大,结论甚至截然相反。勿容置疑,RT-PCR及其相关技术本身所固有的缺点是造成这些差异的重要原因之一。为此,有必要发展新的结直肠癌循环肿瘤细胞检测方法。FACTT(fluorescence amplification catalyzed by T7 RNA polymerase technique,即:T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增)是由美籍华裔学者Zhang等在2006年发明的一种检测血清蛋白质的新方法,具有极高的灵敏度和特异度。本课题在此基础上,建立了检测外周血循环肿瘤细胞的FACTT技术,称之为Cellular FACTT,并运用该技术检测结直肠癌患者外周血中的循环肿瘤细胞,探讨结直肠癌外周血循环肿瘤细胞的检出同患者临床病理因素的关系及其临床意义。研究方法第一部分:建立结直肠癌外周血循环肿瘤细胞的体外模型,分别以CK20和CEA为肿瘤标志物,使用RT-PCR、Cellular FACTT方法检测体外模型中的循环肿瘤细胞,确定每种检测方法的特异度和敏感度。第二部分:使用Cellular FACTT方法检测结直肠癌患者外周静脉血中的循环肿瘤细胞,同时检测患者血清中的CEA、CA199、CA242,并对结直肠癌组织进行免疫组化染色,检测结直肠癌组织中的P53、nm23 H-1表达的变化,分析外周静脉血中循环肿瘤细胞的检出与患者临床病理因素的关系。对术前阴性的患者术后重新检测其外周血中的循环肿瘤细胞,部分患者术后早期化疗,化疗结束后再次检测其外周血中的循环肿瘤细胞。研究结果1.本研究成功建立了T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增法检测结直肠癌循环肿瘤细胞技术,即:Cellular FACTT;以CEA为循环肿瘤细胞标志物,使用Cellular FACTT检测体外模型中的结直肠癌循环肿瘤细胞,其敏感度为最低可从最低可从107个有核细胞中检出5个癌细胞,特异度为96.7%。2. Cellular FACTT检测68例结直肠癌患者术前外周血中的循环肿瘤细胞,51例阳性,总阳性率为75%;3.结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞的检出与TNM分期、肿瘤细胞分化程度、远处转移状况密切相关;4.结直肠癌患者外周血中CEA、CA242、CA199阳性率分别是35.3%、26.5%、32.4%,CEA、CA242、CA199阳性的患者其循环肿瘤细胞检出率是83.3%、72.2%、77.3%,结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞的检出与CEA、CA242、CA199无关;5. 17例术前检测阴性的患者于根治性手术后24小时再次检测,13例阳性,阳性率为76.5%;6. 12例阳性患者于术后早期接受同一方案化疗,化疗结束后再次检测,4例阳性,阳性率为33.3%;7.免疫组化检测p53、nm23H-1在结直肠癌组织中的表达,阳性率分别为57.4%、50%、45.6%,外周血循环肿瘤细胞的检出与结直肠癌组织中nm23H-1的表达密切相关。研究结论1.建立Cellular FACTT方法,将抗体特异性和T7RNA聚合酶的敏感性相结合,检测循环肿瘤细胞,方法可行,可从107个有核细胞中检出5个肿瘤细胞;2. Cellular FACTT方法检出结直肠癌循环肿瘤细胞阳性率与结直肠癌的病理分期、癌细胞的分化程度、M分期密切相关;3.结直肠癌组织中nm23 H-1阴性患者的外周血循环肿瘤细胞阳性率明显高于阳性患者;4.应用Cellular FACTT方法在CEA等血清肿瘤标志物阴性患者外周血中仍有较高的循环肿瘤细胞检出率;5.结直肠癌患者术后早期化疗后外周血中仍可检出循环肿瘤细胞,单一疗程化疗并不能完全杀灭外周血循环肿瘤细胞;6. Cellular FACTT方法检测循环肿瘤细胞对判断结直肠癌预后、指导治疗具有一定临床意义。