茄科植物中FdI与五种病毒外壳蛋白的互作分析

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研究植物病毒编码的蛋白(如外壳蛋白、运动蛋白、复制酶等)与寄主植物的相关蛋白之间的直接相互作用是植物病毒学方向的一个研究热点。新的与病毒互作的寄主因子不断被发现,为我们更深入地了解病毒的致病机理提供了更多信息。  本实验室前期工作发现烟草中FdⅠ蛋白与ToMV CP存在相互作用,在此基础上,本实验采用酵母双杂交技术研究了烟草中FdⅠ蛋白与四种病毒外壳蛋白TMV CP、CMV CP、 PVX CP、TRV CP的互作,说明烟草中FdⅠ与CP的互作是非特异的。那么,其它能够被这五种病毒侵染的其它寄主植物中的铁氧还蛋白FdⅠ能否与这五种病毒的外壳蛋白进行互作呢?我们选取了在农业生产上被广泛种植的三种茄科植物番茄、茄子和辣椒,用RT-PCR扩增出了番茄、茄子、辣椒这三种茄科植物中FdⅠ基因,并将其构建酵母表达载体pGADT7-番茄FdⅠ,pGADT7-茄子FdⅠ、pGADT7-辣椒FdⅠ,将其分别与五种病毒的外壳蛋白共转化至酵母菌AH109,通过酵母双杂交技术来研究它们的铁氧还蛋白FdⅠ能否与这五种病毒的外壳蛋白进行互作。结果表明,番茄、茄子、辣椒这三种茄科植物中FdⅠ蛋白分别与五种病毒CP蛋白在酵母菌AH109中共同表达时可以激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1的表达,从而使酵母菌可以在营养缺陷型培养基上正常生长并能够在X-α-Gal存在的情况下使菌落变蓝,说明它们之间存在相互作用。这为进一步研究病毒的外壳蛋白与寄主植物中铁氧还蛋白互作的分子机制和病害形成机理提供理论依据,并为探索更有效的病害防治策略打下理论基础。  DsRed是一种生物发光蛋白,因红色荧光蛋白RFP具有较强的穿透力,作为酵母、植物和动物等真核细胞内基因表达的报告基因在细胞分子生物学的研究方面越来越受到人们的重视,所以DsRed蛋白可以作为一种新型的报告基因,不仅能够应用于植物、动物细胞基因的表达与调控的研究,还可以作为一种重要的研究方法在蛋白定位、转基因植物的亚细胞定位等方面的研究提供实验思路。不同形式的DsRed蛋白不仅可以在转基因植物中作为一个单独的报告基因,还可以与绿色荧光蛋白GFP一起应用于双重荧光标记实验。  本实验将番茄花叶病毒ToMV CP构建至DsRed荧光蛋白,形成重组质粒。再转入农杆菌,并注射本氏烟叶片,并在荧光共聚焦显微镜下观察其在叶片细胞中的表达结果。ToMV CP-DsRed融合基因的克隆鉴定及在本氏烟叶片细胞中表达具有荧光穿透力强、荧光持续时间长、稳定性好、不破坏细胞结构及观察方便等优点,为进一步分析ToMV CP与寄主植物蛋白互作机制及亚细胞共定位奠定了基础。
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