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研究背景酒精性肝病(ALD)是指由于乙醇摄入过量而导致的肝脏损害等有一系列病变的疾病。根据2006年有中华医学会会肝病分会脂肪肝和酒精性脂肪肝病学组制定的“酒精性肝病诊疗指南”,ALD可分为轻型ALD、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis, AC)五种类型。在西方国家,乙醇是导致肝硬化的最主要因素。英国基于1992年至2001年调查显示酒精性肝硬化占所有肝硬化的38.3%,是肝硬化的主要原斟[1]。在我国酒精性肝病的发病率也日渐升高。稳定可靠的动物模型是研究ALD的分子机制和防治措施的基础。研究发现,慢性酒精性肝病的产生与胰岛素抵抗的联合效应有关[2-8],细胞内信号受损导致肝脏胰岛素抵抗[9],同时也损害受体结合和受体酪氨酸激酶的活性[5,6]。乙醇也会抑制胰岛素受体底物(IRS)蛋白的酪氨酸磷酸化[4,9].因此,慢性酒精性肝病抑制介导DNA合成和肝细胞再生的Erk丝裂原活化蛋白激酶和促进细胞生长、存活、葡萄糖的利用和能量代谢的磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)[9,10]。在小鼠和huh-7肝癌细胞中急性酒精刺激可增加PTEN和PI3K的调节性亚基P85β的相互作用,Akt的磷酸化水平下降,损害胰岛素信号通路[11,12]。胰岛素抵抗可以损害脂质稳态,促进脂质分解[13]并增加脂质毒性,同时也增加了对PI3K/Akt通路的有抑制作用[14,15]和可进一步损害胰岛素信号的神经酰胺[16]。PI3K/Akt通路可由多种细胞因子激活,是细胞功能调节的重要通路,包括转录、翻译、细胞增殖及细胞凋亡[17,18]。胰岛素与胰岛素受体(Insulin Receptor,IR)的β亚基结合使IR磷酸化,激活的胰岛素受体酪氨酸激酶使胰岛素受体底物(Insulin Receptor Substrate, IRS)磷酸化。活化的IRS与具有SH2结构域的p85亚基结合,并进一步激活p110亚基,从而激活PI3K活性。PI3K的激活可使磷脂酰肌醇4,5二磷(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PI(4,5)P2)转化成磷脂酰肌醇3,4,5二磷酸(PI(3,4,5)P3),PI(3,4,5)P3可进一步与Akt的PH结构域作用促使Akt变构,进而使位于Akt C末端调节结构域的Ser473残基及激酶结构域Thr308残基发生磷酸化。活化的Akt通过各种下游信号调控细胞代谢、增殖、分化与凋亡。研究表明,PI3K/Akt通路的调控紊乱与多种疾病相关,如糖尿病、肝硬化、肿瘤[18,19]。长期饮酒可导致胰岛素抵抗等相关的疾病,肝硬化,肝纤维化,肝癌等。研究报道多以工业酒精做为动物研究时的模型。然而,酒精质量对研究结果的可能影响,罕有研究报道。该领域的研究,不仅有益于动物研究模型的优化,对工业酿酒及健康可能有一定的启示。白酒的主要成分是乙醇和水,还包括构成酒体主要成分的有机酸、醇、酯、羰基化合物和芳香族化合物等[20]。由于地域的差异,贮酒容器和水质的不同,生产工艺的差别,使得各地所产的酒中微量元素含量也存在一定差异[21]。国家对白酒中甲醇含量规定了强制执行标准,国内蒸馏酒和酿造酒的卫生标准仅对Pb有限值要求,对Cr、As (GB-2757-81)、Cd、Hg等元素未作规定。长期以来人们在复制酒精性肝病相似的动物病理模型方面做了不懈的努力,现国内外学者广泛应用的ALD模型有Lieber-DeCarli(LD)液体饲料诱导的ALD模型、胃内插管灌注乙醇模型和LD饲料结合灌注模型。在配制液体饲料时常选用无水乙醇或是市售食用酒,对于两类酒精饲养小鼠对造模产生的差异的研究报道很少。本研究旨在探讨小鼠酒精肝造模过程中不同酒质对其体重、肝脏组织病理学及胰岛素信号Akt磷酸化水平表达的影响。第一部分95%工业酒精与酒精肝造模目的酒精性肝病是世界范围内慢性肝病的一种主要原因,而与疾病进展相关的主要发病机制尚不明确,建立与人类酒精性肝损伤病变过程相似的动物模型具有积极的意义。因此我们选取应用最广泛的酒精性肝损伤模型-LD模型,以探讨酒精肝的发病机制。我们试图慢性喂养小鼠含5%工业酒精的Lieber-DeCarl i液体饮食行酒精肝造模,并观察小鼠体重变化、肝脏病理学及对Insulin/PI3K/Akt通路和MEK/ERK通路的影响。方法1、慢性喂养小鼠含5%工业酒精的LD液体饮食行酒精肝造模。8-10周SPF级雄性Balb/c小鼠28只,随机分为对照组和实验组,实验组小鼠喂养含5%工业酒精的LD液体饮食,对照组小鼠喂养对照液体饮食,总时间2个月,实验过程中观察小鼠的精神状态、活动情况、皮毛光泽度、食欲等。每周测量空腹体重,处死前禁食12h,充分麻醉后立即取出肝脏以10%甲醛固定,脱水后行石蜡包埋切片,苏木精-伊红染色(HE),光镜观察病理变化(肝细胞变性、坏死、炎性细胞浸润等),肝脏标本观察肝脏的大小、外形、色泽、质地、切面情况。2、检测肝脏组织中Akt及ERK磷酸化水平。研磨肝脏组织,提取蛋白行western blot检测Akt及ERK的磷酸化水平。3、所得体重数据经SPSS13.0统计软件分析,结果以“平均值±标准差”表示。两组间比较采用两独立样本t检验(Independent-Samples T Test),P值<0.05定义为有显著性差异。结果1、实验过程中实验组小鼠共有4只死亡,可能因为酒精中毒、重度营养不良等。对照组全部成活。2、实验组小鼠体重较对照组小鼠体重明显减轻(p≤0.05),初期实验组小鼠出现易激惹、食欲减退等现象,实验后期精神萎靡、反映迟钝、皮毛光泽度差部分出现脱毛。对照组小鼠则皮毛光泽、体态活泼、食欲正常,无嗜睡现象。3、对照组小鼠肝脏表面光滑细润、色红、边缘锐利、质地柔软,相比之下,实验组小鼠肝脏色泽较正常肝脏暗淡,肝脏体积略增大,包膜紧张光滑,边缘圆钝,质地中等。4、对照组HE染色标本见肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,肝小叶轮廓清晰,肝索排列整齐。偶可见散在小泡状脂肪滴,未见明显肝细胞变性及炎症细胞浸润。实验组可见肝细胞肿大,充满大小不等的脂肪颗粒,细胞核被推向一侧,间质内见炎症细胞浸润。5、工业酒精实验组小鼠肝脏Akt磷酸化水平低于对照组,差异具有显著性(p<0.05)；ERK的磷酸化水平未见明显显著性差异(p>0.05)。结论工业酒精慢性喂养使小鼠体重明显下降,小鼠肝脏Akt磷酸化水平的明显抑制,提示不适合小鼠酒精肝的研究。第二部分不同食用酒行小鼠酒精肝造模的差异比较目的前述实验发现工业酒精会导致造模组小鼠体重的严重减轻,及肝脏Akt磷酸化水平的抑制。因此,我们尝试使用食用酒造模。方法1、慢性喂养小鼠含5%食用酒精的LD液体饮食行酒精肝造模。8-10周SPF级雄性Balb/c小鼠60只,随机分为食用酒A组和食用酒B组,每组随机分为连续组、间隔10天组和间隔5天组,连续组为连续喂养酒精液体饮食40天；间隔10天及间隔5天组,慢性酒精饮食时间为40天,总时间为85天；每周称量小鼠空腹体重。实验过程中观察小鼠的精神状态、活动情况、皮毛光泽度、食欲等。实验结束后处死小鼠,处死前充分麻醉后快速摘取肝脏,部分肝组织用4%中性甲醛溶液固定保存其余肝组织放入液氮中速冻,再移至-80℃冰箱长期保存。肝脏脱水后石蜡包埋切片,苏木精一伊红染色(HE),光镜观察病理变化(肝细胞变性、坏死、炎性细胞浸润等),肝脏标本观察肝脏的大小、外形、色泽、质地、切面情况。2、检测肝脏组织中Akt磷酸化水平。研磨肝脏组织,提取蛋白行western blot检测Akt磷酸化水平。3、统计分析方法基本同上节介绍。结果1、在酒精饮食期间各组小鼠均有饮食量减少,精神状态总体较之前工业酒精实验组好、对照组略差,后期仍较为活泼,皮毛光泽度有所减退,皮肤弹性好,未见明显脱毛。2、持续饮酒40天条件下,两食用酒组之间体重变化无明显差异,但较之前工业酒精组体重减轻少(p<0.05)；间隔10天和间隔5天酒精喂养,食用酒B组较食用酒A组小鼠体重明显增加(p<0.05)。3、各组小鼠肝脏色泽较正常肝脏暗淡,肝脏体积略增大,包膜紧张光滑,边缘圆钝,质地中等。HE染色标本显微镜下可见肝细胞肿大,充满大小不等的脂肪颗粒,细胞核被推向一侧,间质内见炎症细胞浸润。4、在连续和间断10天酒精喂养条件下,与食用酒B相比,食用酒A组小鼠肝组织Akt磷酸化水平显著下降(p<0.05)；在间隔5天条件下,食用酒A组与食用酒B组小鼠肝组织Akt磷酸化水平未见明显差异(p>0.05)。结论本课题发现,1)酒精的质量对酒精肝小鼠模型及该模型下胰岛素信号的变化具有重要的影响。低质量的食用酒精可导致体重的较大降低,及Insulin/PI3K/Akt信号通路的较大抑制。2)因为酒精质量导致胰岛素信号的不同损伤,这个发现可能解开一个一直被忽略的问题：慢性酒精对肝脏的毒害,可能不仅仅是(或不是)乙醇及其代谢物,而且涉及酒精质量中的其它成分。