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体表慢性难愈性溃疡是由多种疾病所导致，发生在体表的长期不愈合创面。主要包括创伤性溃疡、压迫性溃疡、静脉曲张溃疡、糖尿病性溃疡等。该类溃疡在临床极大的影响了患者的生活和工作质量，并且花费巨大。据美国健康保健政策及研究机构(AHCPR)2002年调查统计报告显示，难愈性压力溃疡已经成为截瘫病人的直接死亡原因之一，约占截瘫病人的7-8％，平均护理费用7800美元。另据英国国家卫生局统计，每年用于静脉曲张性溃疡的费用超过3亿英镑。在我国，因体表慢性难愈合创面在外科进行住院治疗者占外科住院患者的1.5%-3%。尽管没有确切的卫生经济学统计数据，但难愈性溃疡给国家和患者造成无比沉重的经济负担已经是毋庸置疑的事实。因此，慢性难愈性溃疡创面防治仍是我国卫生事业所面临的重要挑战之一，积极研究体表难愈性溃疡防治方案具有重要的临床意义。
课题组前期从祛瘀生肌中药调控“生长因子→TGF-β→成纤维细胞→Ⅰ／Ⅲ型胶原”角度部分阐明了中医药创面修复的机理，从而对临床工作具有了重要的指导意义。但对角质形成细胞的增殖及迁移作用机制仍未明了。国内外研究显示，TGF-β，Wnt信号通路分别在角质形成细胞增殖和迁移过程中均占有重要地位。因此，本论文在前期扎实临床和实验研究基础上，主要通过in vitro和in vivo途径分别探讨难愈性创面形成机制，探索中医外科祛腐化瘀生肌法则促进慢性皮肤溃疡愈合的临床疗效及相关机制。主要分为一下几部分：
第一部分研究背景
1.慢性难愈性皮肤溃疡简介；
2.TGF-β信号通路创面愈合中的研究进展；
3.Wnt信号通路在创面愈合中的研究进展；
4.中医药防治慢性难愈性皮肤溃疡的理论研究进展；
5.导师对慢性皮肤溃疡的认识及前期研究；
第二部分创面愈合机制探索：TGF-β拮抗因子Smad7促进创面愈合
目的：观察TGFβ拮抗因子Smad7在创面愈合中的作用并阐明相关机制。
方法：采用Smad7转基因动物模型及其分离培养的角质形成细胞细胞为研究平台，分别从in vitro和in vivo途径阐明Smad7高表达在创面愈合中的作用。HE染色观察其病理结构变化，原位杂交技术检测Ⅰ型胶原mRNA表达，免疫荧光，免疫组化检测TGFβ信号通路相关Smad蛋白(Smad7，pSmad2)表达，细胞增殖指标PCNA及Erk和NF-κB信号通路表达，CD31检测创面血管新生差异，人工Scratch实验观察角质形成细胞Smad7高表达对细胞迁移的影响。
结果：创面角质形成细胞Smad7高表达可显著促进创面愈合。Smad7促进创面愈合的潜在机制与阻断TGFβ和NF-κB信号通路，激活创面ERK信号通路，从而促进创缘角质形成细胞增殖和迁移有关。
结论：创面角质形成细胞Smad7高表达有利于创面愈合。因此，Smad7可能是临床治疗与严重感染，过度疤痕增生，上皮化延迟相关的各种难愈性创面潜在的良好靶点。
第三部分临床研究：祛瘀生肌法治疗难愈性皮肤溃疡的临床疗效及机理探讨
目的：观察中医药(祛腐、化瘀、生肌)治疗方案对糖尿病溃疡的临床疗效，及对Wnt信号通路相关蛋白β-catenin、c-myc及K6表达的影响，建立相关诊疗方案。
方法：采用随机对照研究。确定病例入选标准，共观察病例72例(其中排除4例，拒绝参加6例)，按照随机号分成中医治疗组(CM)和西医治疗组(WM)。CM组31例，WM组31例(期间治疗组失访4例，对照组失访3例)。CM组予以中医祛腐、化瘀、生肌为主的内服和外用中药。WM组予以常规西医外用药与基础治疗。
结果：纳入研究对象的所有患者，溃疡存在均超过1个月，最长者反复不愈2年。CM组治疗后，创面色泽转红润，渗出及异味减少，9／27(33.33%)的患者创面在四周内愈合，WM为7／26(26.92%)，两组比较并无统计学差异(P=0.77)。进一步分析75%创面愈合率显示，CM组有13／27(48.15%)的患者在4周内愈合超过75%，总显效率81.48%。而WM有8／26(30.76%)的患者在4周内愈合超过75%，总显效率为15／26(57.69%)，两者比较具有统计学差异(P=0.04)。CM组创面愈合时间为(22.71±5.46)d，而WM组为(26.56±7.56)d，(t=2.13，P=0.04)。CM组创面提前愈合3d。免疫组化显示β-catenin、c-myc与K6蛋白表达在难愈性创面中增高，创缘β-catenin异常核表达，c-myc、K6在增生的皮肤全层，特别是颗粒层表达增强(P＜0.05)。经祛腐化瘀生肌治疗后有所降低。分别为(101.88±10.76vs140.42±8.45)、(113.27±16.75vs153.79±8.32)与(90.39±11.07vs151.29±7.39)，具有显著统计学差异(P＜0.05)。
结论：祛腐化瘀生肌治疗是治疗慢性难愈性皮肤溃疡的有效方案，显效率81.48%。与传统常规治疗比较，能缩短创面愈合时间3d。其作用机理可能与干预Wnt信号通路有关。
第四部分实验研究：祛瘀生肌中药对角质形成细胞增殖与迁移功能的影响
1.生肌中药黄芪主要成份黄芪甲苷(AstragalosideⅣ)对小鼠角质形成细胞增殖、迁移与细胞周期的影响及其作用机制研究
目的：研究AstragalosideⅣ对小鼠角质形成细胞增殖、迁移和细胞周期的影响及其作用机制。
方法：运用LiCl模拟诱导激活Wnt信号通路的小鼠角质形成细胞或人Hacat细胞为研究平台。采用MTS/PMS法和BrDU掺合法分别检测AstragalosideⅣ对Wnt信号通路激活下角质形成细胞增殖的影响；采用流式细胞仪检测LiCl与AstragalosideⅣ对角质形成细胞细胞周期进程的影响；人工Scratch实验检测LiC和AstragalosideⅣ对角质形成细胞迁移的影响；应用HE光镜、Hoechst荧光染色法观察不同剂量LiCL处理后细胞形态变化；Western bloting检测Wnt信号通路关键蛋白β-catenin，GSK-3β及其下游靶基因c-myc，CyclinD1与增殖相关蛋白PCNA蛋白表达水平；
结果：MTS/PMS检测显示LiCL模拟激活下，角质形成细胞增殖受到显著抑制，在24h，48h，72h时候的IC50分别为25.85±5.03，16.16±0.95，12.35±1.38mM。HE及Hoechst检测显示LiCl干预后角质形成细胞出现形态变大，长梭形改变等“衰老”的特点。CellViability定量检测分析显示细胞大小从正常组15.23±0.96μm变大为17.71±1.01μm(P＜0.02)。但不同浓度LiCL并不诱导细胞凋亡或死亡(P＞0.05)。流式细胞仪进一步检测显示细胞阻滞在S期。BrDU染色显示，LiCL在10mM，20mM，40mM干预24h后，BrDU细胞阳性率分别为57.91±6.573%，23.48±3.19%，9.67±2.45%，与对照组71.81±6.79%相比，药物干预组细胞阳性率明显降低，具有显著统计学差异(P＜0.01)。免疫荧光显示，LiCL处理后角质形成细胞出现β-catenin核表达，Western blot检测进一步显示β-catenin随LiCL浓度增高而表达增强，而细胞增殖指标PCNA呈进行性降低，显示LiCL诱导细胞增殖降低。人工刮擦实验显示，与正常对照组和EGF相比，LiCL阻滞角质形成细胞迁移(P＜0.01)。以20mMLiCL为干预浓度进行模拟研究AstragalosideⅣ对Wnt信号通路激活下角质形成细胞增殖和迁移的影响显示，AstragalosideⅣ可明显改善LiCL模拟激活Wnt信号通路后小鼠角质形成细胞的增殖与迁移抑制，其作用具有时间和浓度依赖性。随着AstragalosideⅣ浓度的增加，β-catenin表达降低，而磷酸化β-catenin增加，p-GSK3β减低，PCNA表达增强，BrDU阳性细胞数目增多。刮擦实验中迁移率增加，提示AstragalosideⅣ改善LiCL诱导的角质形成细胞增殖与迁移抑制与降低β-catenin表达，辅助诱导β-catenin降解有关。
结论：AstragalosideⅣ可改善LiCL诱导模拟激活Wnt信号通路所致的角质形成细胞增殖与迁移抑制，其相关机制与降低β-catenin激活有关。该机制是“生肌法”促进创面上皮化愈合的现代分子生物学机制之一。
2：化瘀药丹参主要成份丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)对角质形成细胞凋亡和细胞周期的影响及其作用机制研究
目的：研究tanshinoneⅡA对小鼠角质形成细胞凋亡和细胞周期的影响及其作用机制。
方法：采用MTS/PMS法与细胞集落形成实验检测tanshinoneHA对小鼠角质形成细胞增殖和单细胞集落形成的影响；光镜，HE与Hoechst染色法分别观察细胞凋亡形态学改变；采用流式细胞仪检测tanshinoneⅡA对角质形成细胞凋亡率及细胞周期的影响，capase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO对tanshinoneⅡA诱导角质形成细胞凋亡的干预作用；流式细胞仪法检测tanshinoneⅡA诱导线粒体膜电位变化；DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder，单细胞凝胶电泳法观察tanshinoneIIA对角质形成细胞DNA凋亡的影响：免疫荧光检测细胞凋亡因子AIF核转移情况；Western blot检测凋亡与细胞周期相关蛋白caspase-3、caspase-8、PARP、cytochromec、cyclinA、PCNA的影响；并利用caspase-3，caspase-8活性检测试剂盒检测细胞内caspase-3和caspase-8酶活性。
结果：TanshinoneⅡA可显著抑制小鼠角质形成细胞增殖，且其作用具有时间和浓度依赖性，在tanshinoneⅡA作用细胞24h，48h，72h后，IC50分别为4.33±1.35，1.89±0.65，1.14±0.87μg／ml。光镜下观察tanshinoneⅡA处理后的细胞，Hoechst染色可见角质形成细胞凋亡，细胞胞体缩小，胞质浓缩，核染色体高度凝聚、边缘化，细胞核碎裂呈碎片状，可见典型的新月形凋亡小体。凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳检测显示tanshinoneⅡA处理组细胞DNA电泳在100～200kd区间可见典型凋亡片段。单细胞凝胶电泳显示tanshinoneⅡA干预处理后细胞呈现明显的彗星尾。免疫荧光检测可见tanshinoneⅡA干预后的角质形成细胞核浓缩，诱导角质形成细胞细胞凋亡呈现剂量关系。同时诱导线粒体膜电位变化，且该变化能被caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO减弱：Western Blot及免疫荧光显示tanshinoneⅡA诱导的角质形成细胞凋亡不诱导AIF核转移，凋亡相关蛋白caspase-3，caspase-8表达增加。采用caspase-3，caspase-8试剂盒检测两者酶表达，发现tanshinoneⅡA诱导caspase-3上调，而对caspase-8没有影响。细胞周期则显示tanshinoneⅡA诱导角质形成细胞呈现S期阻滞，并伴随相关S期相关蛋白cyclinA和pCDK2表达降低。
结论：TanshinoneⅡA可抑制角质形成细胞增殖并诱导凋亡，其作用机制与诱导细胞S期阻滞、激活caspase凋亡信号通路相关，且该效应不依赖凋亡诱导因子(AIF)。化瘀药物通过诱导细胞凋亡可解除创面“缸口”效应，是“祛瘀利于生肌”学术观点的现代分子生物学机制之一。