论文部分内容阅读
目的:探讨实际暴露比例下,镍、锌、铅、铬、镉、铜、汞、锰八种重金属的联合毒性,筛选出有效的拮抗药物,并进一步研究拮抗药物的拮抗机制,为预防膳食暴露途径所致的重金属慢性危害提供科学依据。方法:基于宁波地区人群因水产品膳食摄入而暴露的多种重金属污染物实际比例,配制重金属混合物染毒液。首先采用MTT实验,研究重金属混合物对HL7702细胞生存活力的影响。在此基础上,选取重金属混合物LC75毒性浓度进行细胞染毒,分别加入不同浓度的待筛药物(表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-Gallate,EGCG)、毛地黄黄酮、L-半胱氨酸、牛磺酸、姜黄素、二巯基丙醇、二巯基丁二酸钠、二巯基丙磺酸钠、二氢杨梅素、大蒜素),通过MTT比色法筛选出有效的拮抗药物;再通过线粒体跨膜电位检测、ATP检测、MDA检测、ROS检测、细胞凋亡分析、蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光染色等分子生物学实验手段,探讨多种重金属联合毒性的分子机制和有效药物的拮抗机制。结果:MTT实验结果显示,重金属混合物可诱导HL7702细胞生存活力降低,形态皱缩,其细胞毒性的LC25、LC50、LC75浓度分别为20.58、23.16、25.73mg/L;EGCG和毛地黄黄酮可改善重金属混合物诱导的细胞形态改变和生存活力降低程度;ROS检测结果显示,EGCG和毛地黄黄酮均可降低重金属混合物诱导的ROS水平;线粒体膜电位检测结果显示,毛地黄黄酮可抑制重金属混合物对线粒体功能的损伤,维持染毒后细胞的ATP水平;细胞凋亡检测结果显示,EGCG和毛地黄黄酮均可降低重金属混合物诱导的细胞凋亡水平;蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光实验结果表明,重金属混合物可增大Bax/Bcl-2比例和线粒体外Cytochrome c水平,上调HO-1、MT、Cleaved Caspase-9、Cleavd Caspase-3、Cleaved PARP、p-JNK、p-ERK和p-p38蛋白水平,EGCG和毛地黄黄酮均可抑制重金属混合物诱导的JNK、ERK、p38的磷酸化,降低HO-1蛋白的应激性表达。另外,毛地黄黄酮可阻止线粒体释放Cytochrome c,抑制Capase-9、Caspase-3、PARP等蛋白的剪切活化。结论:重金属混合物可诱导HL7702细胞氧化应激、脂质氧化、线粒体功能损伤,活化MAPK蛋白信号通路,进而应激性上调细胞氧化应激相关蛋白HO-1和MT的水平,同时激活细胞色素C凋亡信号通路,剪切活化Capase-9、Caspase-3、PARP等蛋白,从而诱导细胞凋亡;EGCG和毛地黄黄酮均可保护HL7702细胞免受重金属混合物诱导的氧化应激损伤,下调MAPK通路磷酸化水平;毛地黄黄酮维持线粒体跨膜势能,抑制Cytochrome c进入细胞内液,阻断Cytochrome c/Apaf1/Caspase-9凋亡复合体的形成,降低Caspase-3的活化,从而抑制重金属混合物诱导的HL7702细胞凋亡。