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前言:
喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一。其病理类型主要为喉鳞状细胞癌(LSCC)。近年来,喉癌的发病率逐步上升。我国东北地区喉癌发病率居于头颈部肿瘤首位。喉癌发生发展的分子机制研究将为喉癌的预防和基因诊治提供重要的分子靶标。
肿瘤抑制基因(TSG)的失活在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。启动子区CpG岛的高甲基化可引起TSG表达沉默,使细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生。
5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)是一种DNA甲基化转移酶抑制剂,其通过去甲基化作用使因为CpG岛甲基化而失活的TSG重新表达,获得肿瘤抑制功基因功能。
在前期工作中,我们应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术发现喉癌基因MYCT1的一个新的转录本,命名为MYCT1-TV。RT-PCR结果显示,该基因在肿瘤细胞系中的表达水平显著低于正常细胞系,在喉癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织。转染MYCT1-TV-GFP表达载体的Hep2细胞存活率下调,凋亡率增高,细胞侵袭能力降低,揭示MYCT1-TV可能具有TSG特性。利用双荧光素酶报告基因分析系统、凝胶电泳迁移率分析(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果证实癌基因c-Myc通过结合MYCT1-TV启动子区E-box元件而发挥转录因子的作用。亚硫酸盐测序PCR(BisulritesequencingPCR,BSP)检测结果显示MYCT1-TV启动子区E-box元件中CpG的胞嘧啶均被甲基化(文章已被接收,BMCCancer,2012)。我们推测MYCT1-TV启动子区E-box元件甲基化将干扰其与c-Mvc的结合。
在本项目中,我们拟应用甲基化转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对喉癌Hep2细胞进行去甲基化处理,通过半定量RT-PCR和qPCR、BSP和ChIP实验分别检测处理前后MYCT1-TV基因转录水平、E-box序列的甲基化状态和E-box元件与c-Myc结合能力的变化;另一方面,通过EMSA实验检测启动子E-box元件甲基化状态对其与转录因子c-Myc结合能力的影响。
材料与方法:
5-Aza-dC(4μmol/L)处理喉癌Hep2细胞,利用RT-PCR和qPCR检测处理前后MYCT1-TV基因的mRNA表达水平,BSP检测处理后E-box序列的甲基化状态。利用EMSA和ChIP实验检测甲基化对MYCT1-TV基因与转录因子c-Myc结合能力的影响。
实验结果:
1、5-Aza-dC处理前后喉癌Hep2细胞中MYCT1-TV基因与beta-actinmRNA表达水平的灰度值之比分别为0.2085±0.0234和1.2821±0.04,差异具有显著性(P＜0.05);MYCT1-TV基因与GAPDHmRNA表达水平的kQ值之比分别为1±0.2450和6.11±0.4582,差异具有显著性(P＜0.05)。
2、BSP结果显示5-Aza-dC处理后喉癌Hep2细胞中MYCT1-TV基因E-box序列发生去甲基化。
3、EMSA实验结果显示MYCT1-TV基因E-box序列甲基化特异性探针与核蛋白有微弱的结合,提示E-box序列甲基化干扰了MYCT1-TV基因与c-Myc的结合。
4、ChIP实验结果表明5-Aza-dC处理Hep2细胞后E-box序列与c-Myc结合能力较处理前显著增强,处理前后E-box与Input灰度值之比分别为0.1391±0.0225和0.4964±0.0134,差异具有显著性(P＜0.05);E-box与InputRQ值之比分别为1±0.2136和8.374±0.9212,差异具有显著性(P＜0.05)。
结论:
MYCT1-TV基因启动子区甲基化干扰了启动子与转录因子c-Myc的结合,去甲基化增强了二者的结合,致该基因表达上调。