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趋磁螺菌Magnetospirillum magneolaclticum AMB-1是Matsunaga等1991年分离到的一株水生螺菌,可沿地磁的磁力线方向运动,菌体内含有自身合成的数目不等的磁小体颗粒。它在微生物学、生化、生物物理学、古生物学、生物进化、生物磁学和仿生学等许多领域有极大的潜在应用价值。目前趋磁细菌相关的研究热点包括:机体如何在分子水平上合成磁小体;磁小体合成共需要多少基因、蛋白,这些基因又是如何参与及调控调控磁小体合成的。
本论文拟通过电转化法初步建立趋磁螺菌基因转移体系,并应用分子生物学技术克隆AMB-1菌株中与其特殊生长生理特性及磁小体合成相关的功能基因,如超氧化物歧化酶(SOD)和铁氧化还原酶(FeR)基因,并在大肠杆菌(Escherichiacoli)中对其进行了表达和功能的初步分析,为进一步研究趋磁细菌的微好氧生长特性及磁小体的合成机制打下基础。主要研究结果如下:
1.初步建立趋磁螺菌基因转移体系
构建AMB-1基因组随机片段文库,同时扩增magA基因片段,构建质粒pMDl8-T(magA),分别电转化AMB-1。经实验对比,对数生长中期的感受态效果最好,如果OD<,600>值过低或过高都会使转化效率降低,感受态的终浓度在2~5×10<10>cells/mL为好;在制备感受态前将菌体进行活化,会明显降低致死率;电击缓冲液选用含有272 mM蔗糖的10mM TES buffer(pH7.5);为降低致死率,研究发现在对AMB-1的电脉冲中,选用的最佳条件:2000v,25μF,200Ω。当电压进一步加大,穿孔的膜面积增大,结果虽然细胞转化率增大但是由于细胞存活率的下降,转化率不升反降。为了提高电击转化效率,电转化的各种条件还有待进一步探索。
2.超氧化物歧化酶基因和铁还原酶基因的克隆及原核表达
通过PCR技术,从趋磁螺菌Magnetospirilum magneticum AMB-1基因组DNA中扩增得到超氧化物歧化酶基因和铁还原酶基因序列。序列分析发现超氧化物歧化酶(SOD)基因片段包含一个编码199个氨基酸残基的开放阅读框,蛋白同其
它种属Fe-SOD具有很高同源性;铁还原酶基因序列为1332bp,该片段所含的开放阅读框编码444个氨基酸残基。构建表达质粒pET22bS和pET22bF,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SOD基因得以活性表达。
3.SOD蛋白纯化和活性检测
通过Ni<+>亲和层析纯化,获得了高纯度的目的蛋白。纯化后的目的蛋白用连苯三酚方法检测表明,该蛋白具有一定的SOD活性,表明SOD基因得到正确表达。