濒危植物青岛百合种质的超低温保存技术的研究及遗传稳定性分析

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种质资源保存除了原生境、异生境、种子、组培苗等常规保存方法以外,超低温保存因为其保存时间长久和经济,越来越受到人们的关注。青岛百合是濒临灭绝的物种资源,为长期保存这一资源,本文对青岛百合的组织培养和超低温保存体系进行了初步研究。   主要研究结果如下:   1.青岛百合的离体快速繁殖体系的建立。   以青岛百合及麝香百合的鳞片、茎尖、叶片为实验材料,研究了外植体的放置方式、鳞片及鳞茎的不同部位、不同的激素浓度及活性炭浓度对百合再分化的影响,成功建立了青岛百合和麝香百合的高频再生体系。两种百合的最佳外植体部位为中层鳞片的基部,放置方式为凸面接触培养基,青岛百合的再生培养基为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L,麝香百合的最佳再生培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1 mg/L,两个品种的百合最高再生率均可达到100%。利用茎尖和叶片进行探究,均可得到再生植株。   2.青岛百合的玻璃化超低温保存方法的建立。   经过实验结果显示:预培养时间、预培养培养基、玻璃化脱水以及冻后处理对百合茎尖的再生率都有很大的影响。我们摸索出玻璃化法保存青岛百合茎尖的优化程序为:2-3mm的茎尖在MS为基本培养基的100g/L海藻糖+1mg/LABA的培养基上4℃条件下培养3天,用loading液在25℃下处理20min后用PVS2在0℃条件下处理60min,重新装入新的PVS2溶液后直接放入液氮中,保存1h之上后取出38℃快速化冻2min,用洗液MS+1.2mol/L蔗糖清洗2次,每次10min,转接至恢复培养基上暗培养7天后,光照培养,约20-30天后便可见有恢复生长,再生率可达到83.3%,而且茎尖不经过愈伤组织直接再生。   3.青岛百合的包埋-玻璃化超低温保存方法的优化。   切取直径1-2mm大小的青岛百合的茎尖,在MS基本培养基上添加0.4mol/L蔗糖、1mg/LABA4℃进行预培养3天后进行茎尖的包埋,包埋液为含有0.4mol/L蔗糖和2mol/L的甘油的6%褐藻酸钠。包埋后在超净台内干燥1h,用PVS2在0℃进行玻璃化脱水1h,换取新鲜的PVS2后直接放入液氮保存1h以上后,38℃快速化冻2min后利用去装载液去装载2次,每次10min,利用解剖刀划破胶球后取出茎尖并转接至恢复培养基MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+NAA0.1mg/L上进行暗培养,7d后用TTC检测存活率可达到70%。   4.再生植株的形态观察及SSR分析。   所有处理过的茎尖在恢复处理两周内生长都很缓慢,而对照组幼苗则生长很快。经过处理后的植株形态大小和正常生长后的植株体基本一致。利用SSR分析,结果显示,超低温处理过的再生苗与未经过处理的组培苗的扩增特异性条带一致,没有出现差异性条带。
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