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胡杨具有很强的抗旱耐盐碱能力,是生长在沙漠地区少有的乔木树种,主要分布于中国、俄罗斯、蒙古、中亚和北非的荒漠地区。在我国主要分布于新疆、内蒙古、甘肃…等西北部省区荒漠地区的边缘。胡杨对维持当地脆弱的生态环境起着重要的作用,阐明其抗旱耐盐碱机制无疑具有重要的理论和实际应用价值。
关于胡杨的抗逆性研究,已有不少工作。为了更深入阐明胡杨的抗逆机制,我们对天然生长在新疆塔里木河流域、塔克拉玛干沙漠的天然胡杨林进行了实地调查、现场采样(包括盐碱胁迫和干旱胁迫的样品)和室内相关实验;以悬浮培养胞为材料,以盐敏感的毛白杨为对照,分别用PEG和NaCl模拟干旱和盐害胁迫处理悬浮细胞,比较胡杨和毛白杨悬浮细胞在模拟盐胁迫和干旱渗透胁迫处理时的基因表达差别,进而阐明胡杨在细胞水平对逆境胁迫的适应机制。
对新疆盐胁迫样品取样地土壤分析结果显示,土壤表面的Na+含量高达20%以上。虽然随着土层深度的增加Na+含量有所下降,但是在20cm深处Na+含量仍然达到5%以上。另外,分析可知,从土壤表面到20cm处的pH值大约为9,表明环境中高含量的Na+是主要的胁迫因素,同时存在高pH胁迫。
对胡杨叶片的分析结果表明,在土壤高Na+含量和高pH胁迫下,胡杨叶片主要将Na+富集在质外体,使其质外体的pH值在7以上,高于大多文献报道的5.5-5.7范围,而细胞质中则维持较低的Na+含量和接近中性的pH值。与生长在非盐胁迫生境中的胡杨对照相比,NaCl和高pH胁迫下胡杨叶片的质膜H+-ATPase水解活性有明显提高,比对照提高了14%,为对照的1.14倍;但质膜H+-ATPase质子转运活性变化不明显;无论是对照和胁迫样品,其叶片的质膜Na+/H+antiporter都没有活性。以上结果表明,在NaCl和碱性pH条件胁迫下,质外体Na+的积累不是由于质膜Na+/H+antiporter从细胞质向质外体外排造成的。
胡杨在干旱胁迫下,叶片的蒸腾作用明显减少,气孔阻力增加。严重干旱胁迫后,叶片中的K+和Ca2+含量增加,分别为对照1.43倍和2.99倍,而Mg2+和Na+变化不明显。和对照相比,中度干旱胁迫下胡杨叶片质膜H+-ATPase的质子转运活性没有差别,但严重干旱胁迫则使其活性降低,质膜H+-ATPase转运质子的能力下降。
悬浮细胞实验表明,在PEG和NaCl处理后,细胞中的Na+含量变化不大,胡杨和毛白杨Na+总量相近。K+含量分析显示,在PEG和NaCl处理的起始阶段,胡杨悬浮细胞的K+含量有较明显的上升,而NaCl处理后毛白杨中的K+含量没有明显变化,处理4d才有较小的上升,并且毛白杨悬浮细胞内的K+总量低于胡杨细胞内的K+总量。
电导率分析结果显示,NaCl处理对胡杨悬浮细胞膜透性影响不大,无论处理4d,8d和16d,其相对电导率值变化趋势与对照相似。100mMNaCl处理则使毛白杨悬浮细胞相对电导率值显著增加,而且随着处理时间的延长,其相对电导率值继续增加。PEG处理的胡杨和毛白杨悬浮细胞与各自的空白对照细胞相对电导率变化相似。
培养基pH分析表明,在悬浮培养过程中,胡杨和毛白杨培养基的pH都有所下降。胡杨细胞在NaCl处理后,培养基pH值下降的幅度和对照差别不大。而毛白杨悬浮细胞100mMNaCl处理后,其培养基的pH下降明显,处理4d后,从起始的5.5左右下降到3.3左右。PEG处理后的胡杨和毛白杨悬浮细胞,培养基pH变化值和各自的对照变化相似。
对PtNhxl的分析表明,50mMNaCl处理30min使毛白杨悬浮细胞中PtNhxl的表达量增加,没有检测出该基因在NaCl处理后的胡杨悬浮细胞的表达。对PtNhaDl的分析显示,检测到NaCl处理毛白杨悬浮细胞中PtNhaDl的表达,但对照和NaCl处理毛白杨悬浮细胞之间没有差别。
为了进一步分析胡杨质外体Na+积累机制,我们对可能存在于杨树质膜上的Na+转运蛋白进行了探讨,运用生物信息学方法对假定的杨树质膜Na+-ATPase基因进行电子克隆及筛选,我们克隆得到1条未报道的基因序列,可能为杨树质膜Na+-ATPase基因,并命名为PPPNAlcDNA。同时,电子克隆得到6条杨树质膜H+-ATPase基因序列,并对其进行生物信息学分析,筛选后得到1条杨树质膜H+-ATPase基因序列。
为了利用分离的质膜微囊研究Na+的跨膜运输机制,在研究中,我们用毛白杨叶片为材料,成功的制备了正包反应液和Na+的质膜微囊,并建立了一种直接测定质膜H+-ATPase依赖的Na+跨膜转运的方法,可通过有效的控制质膜内外条件,比如ATP浓度,pH值和离子含量等来研究Na+的跨膜转运。