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背景和目的：
食管癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一,患者的死亡率在恶性肿瘤中居第四位。食管癌的早期浸润转移是患者治疗效果不佳的主要原因,因此抑制食管癌淋巴结转移和邻近组织侵袭是有效治疗食管癌、提高食管癌生存率的关键。
肿瘤的侵袭转移指恶性肿瘤细胞脱落离开其原发部位,通过血液、淋巴液等渠道转运到不连续的靶组织,继续增殖生长为同样性质肿瘤的过程。目前研究认为上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤发生浸润转移的重要必要的起始步骤。在EMT过程中,上皮细胞失去了极性,细胞间丢失上皮性标志E-钙粘蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(zonula oc-cludents-1,ZO-1)等,获得波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)等间质性标志,同时细胞的侵袭运动能力增强。大量研究表明多种信号通路参与了肿瘤细胞的EMT过程,如Wnt、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Notch信号通路等。许多数信号分子的诱导作用都依赖于不同的细胞环境,而TGF-β则被认为是几乎所有上皮组织发生EMT所必不可少的诱导因素。
基质金属蛋白酶(matix metalloproteinase,MMPs)是一类与肿瘤的浸润和转移关系密切的蛋白水解酶,其中MMP-2又在其中起到关键作用,MMP-2高表达与人类多种恶性肿瘤浸润、转移潜能及预后有着紧密联系。不过目前有关MMP-2在侵袭转移中的作用机制研究主要局限在其作为细胞外基质降解酶降解ECM,或者刺激血管内皮细胞合成DNA,促进合成、释放多种血管生长的调节因子等方面。有文献报道敲除鼠乳腺癌细胞的SMI2S基因时,EMT发生的同时MMP-2的表达水平发生了下调。TGF-β也可以影响MMP-2的表达,有文献报道,用山蓑若碱抑制肝细胞纤维化时,TGF-β的表达水平下调,同时MMP-2蛋白的表达也随之下调。可见MMP-2也可能通过参与EMT来参与肿瘤的侵袭转移过程,但食管癌中MMP-2是否参与EMT的发生,是否也可通过EMT参与食管癌的侵袭转移过程国内外报道甚少。
因此本实验拟探讨MMP-2在食管癌EMT中的作用,特别是MMP-2在TGF-β信号通路介导EMT过程中的作用,为了进一步深入了解MMP-2在食管癌侵袭转移中的作用机制提供实验基础。本实验首先采用RNAi技术特异性抑制食管癌细胞MMP-2的表达,观察MMP-2沉默后食管癌细胞EC9706中E-cadherin、vimentin表达的改变以及食管癌细胞侵袭能力的改变,探讨MMP-2在食管癌EMT发生时的作用。其次以外源性的TGF-β1刺激及与MMP-2 siRNA联合应用,观察食管鳞癌细胞EC9706中E-cadherin和vimentin表达的改变,以及对细胞侵袭能力的影响,分析MMP-2在由TGF-β1介导的EMT中的作用。
材料和方法：
1 MMP-2 siRNA转染食管鳞癌细胞EC9706
1.1设计合成siRNA,采用阳离子脂质体试剂瞬时转染食管癌细胞EC9706,利用荧光定量PCR和Westemblot检测MMP-2 siRNA转染后MMP-2基因的沉默效果,并筛选适宜的转染浓度的MMP-2 siRNA,以便于用于下一步实验。
1.2于倒置显微镜下观察MMP-2基因沉默后细胞的形态学变化;
1.3 Western-blot法检测MMP-2 siRNA转染后0h(转染前)、24h、48h、72h细胞中MMP-2、E-cadherin、vimentin蛋白的表达;
1.4以MTT方法检测EC9706细胞增殖能力的变化;
1.5 Boyden chamber侵袭小室检测转染后EC9706细胞侵袭能力的变化;
1.6于转染MMP-2 siRNA后48h,采用细胞划痕实验检测MMP-2基因表达下调后食管癌EC9706细胞迁移能力的变化
2以外源性TGF-β1刺激食管鳞癌细胞EC9706
2.1于倒置显微镜下观察空白对照组(blank组)、TGF-β1刺激及TGF-β1刺激与MMP-2 siRNA联合作用下细胞的形态学变化;
2.2 Western-blot法检测空白对照组(blank组)、TGF-β1刺激及TGF-β1刺激与MMP-2 siRNA联合作用下0h(转染前)、24h、48h、72h细胞中MMP-2、E-cadherin、vimentin的蛋白的表达;
2.3 Boyden chamber侵袭小室实验检测在空白对照组(blank组)、TGF-β1刺激及TGF-β1刺激与MMP-2 siRNA联合作用下EC9706细胞侵袭能力的变化。
3统计学处理
以统计软件SPSS17.0进行统计学分析。计量资料用(X)±S表示,两组均数的比较用t检验,两组以上均数的比较用单因素方差分析。以α=0.05为检验标准。
结果:
1 MMP-2 siRNA干扰实验结果:
1.1不同浓度MMP-2 siRNA转染EC9706细胞后Real-time PCR检测对MMP-2mRNA的抑制效率,结果显示转染浓度为50nM MMP-2 siRNA时MMP-2 mRNA抑制率达到84％,干扰效率最高。Western-blot检测浓度为50nM MMP-2 siRNA转染后MMP蛋白的相对表达量为(0.72±0.03),与blank组和NC组(1.13±0.02,1.14±0.04)相比差异显著,有统计学意义。
1.2形态学改变:
转染MMP-2 siRNA后部分细胞发生皱缩,细胞形态变得不规则,细胞内的颗粒增多,细胞折光性降低,培养液中的细胞碎片增多;
1.3 Western-blot结果:干扰后MMP-2蛋白的表达在48h(48h:0.555±0.045、72h:0.356±0.041),与同一时间blank组(0.705±0.027、0.692±0.054)及NC组(0.694±0.111、0.689±0.077)相比显著下降,(P＜0.05),有统计学意义,在干扰组中72h与48h之间差异具有统计学意义(P＜0.05);转染后,E-cadherin蛋白的表达量逐渐升高,48h与24h相比(0.452±0.055 vs0.309±0.032)差异有统计学意义(P＜0.05),72h与48h之间差异也具有统计学意义(0.623±0.042 vs0.452±0.055,P＜0.05),且48h与72h时干扰组E-cadherin蛋白的表达量与同一时间blank组(0.305±0.023、0.315±0.067)及NC组(0.304±0.032、0.313±0.028)相比差异明显(P＜0.05),有统计学意义:随着干扰时间的延长,波形蛋白的表达量逐渐降低(0.565±0.033、0.448±0.035、0.357±0.041),差异具有统计学意义(P均＜0.05),同一时间干扰组与blank组(0.695±0.032、0.707±0.037、0.680±0.045)及NC组(0.705±0.037、0.714±0.021、0.699±0.040)相比波形蛋白的表达差异有统计学意义(P均＜0.05);
1.4 MTT实验结果:转染后MMP-2 siRNA转染组细胞的增殖水平较同一时间各对照组(blank组及NC组)下降,其中在48h、72h时,转染组(0.745±0.026、0.824±0.012)与同一时间blank组(0.862±0.033、1.025±0.077)及NC组(0.839±0.034、1.002±0.011)之间差异有统计学意义(P均＜0.05);
1.5体外侵袭实验结果:MMP-2s iRNA转染后细胞的体外侵袭能力逐渐下降(89.80±6.98、68.80±10.43、47.60±8.32),48h与24h相比差异有统计学意义,72h与48h相比差异有统计学意义(P均＜0.05),同时,在48h和72h时,干扰组与blank组(97.40±4.72、88.00±7.65)及NC组(85.80±5.40、90.60±5.13)相比穿膜细胞数有显著性差异,有统计学意义(P均＜0.05);
1.6转染MMP-2 siRNA抑制食管癌细胞EC9706 MMP-2基因的表达后,细胞划痕24h后blank组和NC组细胞间的划痕明显愈合(0.70±0.02,0.72±0.01),而MMP-2 siRNA转染组几乎没有愈合(2.80±0.03);48h后blank组和NC组已经完全愈合(0,0),MMP-2 siRNA转染组仅有少量愈合(1.88±0.02)与其它两组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。
2 TGF-β1刺激食管鳞癌细胞EC9706:
2.1形态学的改变:TGF-β1作用后与blank组相比部分细胞的体积变大,细胞延长,形状由多边形向长梭形改变,而且细胞排列变得松散,细胞之间的间隙增宽:T6F-β1与MMP-2 siRNA共同作用下部分细胞发生皱缩,细胞内的颗粒增多,细胞的折光性降低,培养液中的细胞碎片增多;
2.2 Western-blot结果:T6F-β1刺激组各指标的蛋白表达量与blank组相比均有显著差异,有统计学意义(P均＜0.05),其中,MMP-2蛋白和波形蛋白的表达量显著上升(0.745±0.077 vs0.633±0.064,0.678±0.076 vs0.575±0.047),E-cadherin蛋白的表达量显著下降(0.284±0.035 vs0.426±0.031);TGF-β1与MMP-2 siRNA共同作用组MMP-2蛋白与波形蛋白的表达与TGF-β1单独作用相比明显下降(0.435±0.069 vs0.745±0.077,0.554±0.035 vs0.678±0.076),E-cadherin蛋白的表达量明显上升(0.418±0.057 vs0.284±0.035),差异显著具有统计学意义(P均＜0.05);
2.3体外侵袭实验结果:TGF-β1作用组的穿膜细胞数显著高于blank组(99.70±11.89 vs79.29±9.47),差异显著,具有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1与MMP-2 siRNA共同作用组穿膜的细胞数明显下降,与TGF-β1单独作用组相比差异显著(84.80±13.29 vs99.70±11.89,P＜0.05),有统计学意义。
结论:
1.抑制MMP-2基因,食管癌细胞EC9706的E-cadhcrin蛋白表达增加、vimentin蛋白的表达下降,表明MMP-2参与了食管癌EMT的发生。
2.外源性TGF-β1能够诱导食管鳞癌细胞发生EMT样改变,增强细胞的体外侵袭能力;MMP-2 siRNA能够抑制由TGF-β1引起的EMT。
3.抑制MMP-2基因,食管癌细胞EC9706的侵袭和迁移能力明显被抑制,表明参与EMT可能是MMP-2在食管癌侵袭转移中发挥作用的可能机制之一。