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椎管内神经阻滞是临床上常采用的麻醉方法,能保持患者清醒,麻醉恢复平稳,易于术后镇痛,节省医疗费用。但自1991年来陆续出现关于局麻药椎管内麻醉后发生神经并发症的报道。近年来多种研究(前瞻性、回顾性、流行病学、荟萃分析等)发现椎管内神经阻滞后出现神经并发症的发生率为1/1000-1/1,000,000。Rigler等人于1991年报道了四例病人连续椎管内神经阻滞后出现马尾神经综合症(canda equina syndrome, CES),由此对椎管内应用局部麻醉药的安全性产生质疑。两年后,Schneider等于1993年发现椎管内应用5%的利多卡因发生了一过性神经综合症(transient radicular irritation, TNS)。大量临床研究的结果提示：椎管内神经阻滞并发症高于硬膜外阻滞,其中TNS的发生率高于CES,而且使用利多卡因较布比卡因出现两者的几率高。临床上,CES表现为会阴区的麻木感和感觉减退,还有大小便功能的失常,并伴有下肢运动功能的障碍；而TNS的疼痛症状表现为从臀部开始向两下肢放射,疼痛的强度有轻有重,可伴有下肢无力、麻木、感觉异常或尿潴留等。TNS一般在5天内可自行恢复,而CES神经功能恢复时间长或有可能导致永久性的神经功能障碍。总体来说,出现神经并发症的患者当中有85%的患者的神经功能可在三个月内恢复正常。引起这些并发症的原因有局麻药、直接穿刺或留置导管对神经的损伤、脊髓缺血、感染等。其中最重要原因有脊髓直接穿刺损伤和局麻药物毒性。大量的研究表明脊髓损伤可引起局部炎性细胞因子释放,同时出现了神经功能障碍。为了减少穿刺带来的脊髓直接损伤,自1841年以来,历史上众多学者对腰穿刺针已经进行了多达24次的研发,分别从针尖形状及针直径大小改进。包括早期的切割式针尖到现在的笔尖式针尖,大小也从13G缩小到现在25G、27G甚至29G。但临床上神经穿刺损伤情况仍然不能完全避免。目前对局麻药引起神经组织的超微结构、代谢以及电生理改变成为减少神经并发症的研究重点。局麻药对脊髓神经细胞毒性的研究不但有临床观察、动物实验、细胞水平探讨,也有细胞内线粒体、钙离子及分子水平的研究。但脊髓穿刺损伤后局麻药注射对脊髓组织功能的影响目前还少见报道。为此,本研究拟从动物整体水平,建立脊髓针刺损伤动物模型,通过观察脊髓组织损伤后炎性细胞因子变化及局麻药注射后对脊髓组织炎性细胞因子的影响,探讨局麻药神经毒性与炎性细胞因子的可能关系,为临床防治针刺损伤后局麻药注射的神经毒性提供理论依据。第一章大鼠脊髓针刺损伤动物模型的建立与评价目的研究局麻药的脊髓毒性作用机制,需建立理想的大鼠脊髓针刺损伤动物模型。本研究通过观察损伤后病理生理、运动及电生理改变,模拟临床情况,寻找对脊髓损伤程度最小的方法,为研究局麻药脊髓毒性提供可信的动物模型。方法健康SD大鼠144只,体重150g-200g,雌雄不分。随机分为对照组(假手术组,n=36)和实验组(n=108)。实验组按脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)程度分为A组(29G,n=36),B组(25G,n=36),C组(21G,n=36)。健康SD大鼠称重并记录。麻醉诱导：吸入3%七氟醚；麻醉维持：吸入2%七氟醚。大鼠取俯卧位,背部去毛后常规消毒,后沿背部正中线切开皮肤。分离脊柱两侧肌肉,充分暴露脊柱棘突两侧,找到L5横突及椎间孔。确定位置后,用细咬骨钳咬除L4棘突,暴露L4-5节段间的硬脊膜。直视下分别用21G、25G、29G带斜面的针以与脊柱尾端成60。角沿神经脊髓正中向头部刺入L4-5节段脊髓,以大鼠出现尾动为有效穿刺损伤,停留2秒后拔出针头,依层分别缝合肌肉、皮下筋膜及皮肤。记录手术操作时间。术毕肌注青霉素钠4万单位,术中台灯照射保温。大鼠分组饲养,每日检查伤口有无感染。假手术组除不穿刺损伤脊髓以外,其余同实验组。术后常规人工排尿2-3次,直至膀胱恢复自主排尿。大鼠检测点：每组分别在术前进行双后肢运动功能评分,然后进行术后8h、24h、72h、1w、2w时点检测电生理,每时点6只大鼠,检测结束后处死大鼠,取相应节段脊髓进行HE染色进行病理观察。各组大鼠分别在术后8h、24h、72h、1w、2w进行运动功能评分(BBB评分),检测运动诱发电位(motor voked potentials, MEP)和观测组织切片。本研究各组SD大鼠数据以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 13.0统计软件包进行分析,组间比较采用完全随机设计资料的方差分析,组间多重比较采用LSD法。P<0.05为有统计学意义。结果本实验暴露脊髓手术操作时出血约0.2ml～0.3ml,给予腹腔注射生理盐水0.4ml～0.6ml补充血容量。穿刺损伤脊髓后,由于穿刺针的大小不同,各组脊髓局部充血程度不同。整个实验中C组有1只因麻醉过深呼吸抑制缺氧死亡,死亡率为2.8%；A组和B组无死亡。术后8h,所有大鼠均完全清醒。C组各时点与对照组相比BBB评分有统计学差异(P<0.05),随着时间的延长,BBB评分有所恢复。术后24h,B组与对照组相比BBB评分72h以内有统计学差异(P<0.05)。C组BBB评分与对照组各时点相比无统计学差异,A组损伤后恢复最快,8h后与对照组BBB评分无统计学差异(P>0.05)；B组次之,72h时BBB评分为(19.5±0.5),1w后完全恢复；C组损伤最重,运动恢复最差,1w时BBB评分(16.7±1.4),到2w时也未完全恢复正常。C组在2w后部躯体出现轻度萎缩,并且由于长期触地、摩擦,尿道口伴轻度糜烂。术后各实验组MEP峰潜伏期72h后与对照级相比较无统计学差异(P>0.05)。8h时,A组MEP峰潜伏期与对照组无统计学差异(P>0.05),但B组、C组24h时MEP峰潜伏期与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。实验各组间MEP峰潜伏期有统计学差异(P<0.05)。C组与B组MEP峰潜伏期在损伤后72h后与对照组相比无统计学差异(P<0.05)。脊髓组织病理改变实验组可见充血、水肿改变,主要位于脊髓穿刺周围。实验组8h时可见脊髓损伤周围充血水肿。A组损伤早期出血、水肿,至24h时可见充血、水肿缓解。术后72h水肿消退,可见淋巴细胞浸润,毛细血管增生,可见到神经元卫星现象,至第1w时增生的炎性细胞和毛细血管逐渐恢复正常。A组各时点无神经元固缩坏死。结论本实验通过行为学、神经电生理及病理学评估,以大鼠作为实验动物,仿照人类椎管内神经阻滞真实过程的方法,应用29G穿刺针建立大鼠脊髓针刺损伤动物模型,具有针刺精确、损伤小、重复性好的特点,为将局麻药脊髓直接注射后研究局麻药毒性机制提供了可信的动物模型。第二章脊髓针刺损伤后罗哌卡因对脊髓炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的影响目的通过研究罗哌卡因脊髓内注射后细胞因子变化探讨罗哌卡因的脊髓毒性的可能作用机制及判断脊髓毒性的预后。方法SD大鼠144只随机分为对照组(n=36)和实验组(n=108)。对照组：暴露脊髓硬膜后只用29G针头行脊髓穿刺损伤,不作注射(n=36)；NS组(A组)暴露脊髓硬膜后用29G针头行脊髓穿刺损伤并脊髓内注射生理盐水4μl(n=36)；0.5%罗哌卡因组(B组)暴露脊髓硬膜后用29G针头行脊髓穿刺损伤并脊髓内注射0.5%罗哌卡因4μl(n=36)；2%罗哌卡因组(C组)暴露脊髓硬膜后用29G针头行脊髓穿刺损伤并脊髓内注射2%罗哌卡因4μl1(n=36)。脊髓针刺损伤模型制备,同第一章。采用过氧化物酶标记的链菌素亲生物素复合物(SABC)法对8h、24h、72h、1w、2w各时点脊髓组织4种细胞因子进行检测;实时荧光定量PCR法检测脊髓组织4种细胞因子的mRNA表达。检测步骤：①无菌收集大鼠脊髓组织；②提取脊髓组织总RNA。③逆转录反应,在逆转录酶M-MLV的作用下,将mRNA转录成cDNA分子。④定量PCR反应。⑤根据FTC—2000软件分析数建立标准曲线。⑥根据公式计算出待测基因相对定量值。免疫印迹(Western blotting)检测脊髓组织4种细胞因子蛋白的相对表达,检测步骤：脊髓组织总蛋白的提取,蛋白质浓度测定,SDS-PAGE胶电泳,转膜,免疫检测,蛋白条带灰度用Kodaka Digital密度扫描仪扫描分析。本研究各组SD大鼠数据以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 13.0统计软件包进行分析,组间比较采用完全随机设计资料的方差分析,组间多重比较采用LSD法。P<0.05为有统计学意义。结果(1)免疫组化检测发现,对照组和A组,IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表达主要在炎性浸润细胞浆。B组和C组大鼠脊髓损伤后8h、24h、72h、1w、2w各时点IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的均有阳性表达,但随时间延长,阳性表达细胞数逐渐减少；与对照组相比,B组和C组大鼠脊髓组织IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表达增加有统计学差异,P<0.05。脊髓损伤后2w,B组与C组IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表达阳性数减少,与对照组相比较没有统计学差异(P>0.05)；与对照组相比,A组大鼠脊髓组织IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表达略有增加,无统计学差异,P>0.05。(2)免疫印迹检测脊髓组织对照组与0.5%罗哌卡因组的4种细胞因子蛋白的相对表达结果。罗哌卡因脊髓内注射后第8h,0.5%罗哌卡因组大鼠脊髓组织IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白表达水平(分别为16.38±1.83,14.65±2.28,19.09±1.68和21.67±2.43)均高于对照组(分别为4.53±0.47,3.89±0.43,4.77±0.39和5.31±0.38,P<0.01)结论脊髓穿刺损伤后注射罗哌卡因可引起脊髓组织释放细胞因子增加,且与罗哌卡因浓度有关。但单次的罗哌卡因注射对脊髓组织释放的细胞因子的影响时间短。罗哌卡因可能通过增加IL-1β、IL-6及TNF-a细胞因子加重了脊髓损伤后对脊髓组织的毒性作用,而IL-10的增加对其他促炎因子有抑制作用。因此,本实验结果表明,IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-a可能是脊髓损伤后的重要免疫标志物。提示临床上罗哌卡因注射到损伤的脊髓组织可加重局部炎症或可引起神经功能异常,因此必要时检测脑积液IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-a,有助于脊髓损伤的及时诊断、病情程度判断同时也为合理治疗罗哌卡因脊髓注射损伤提供理论依据。第三章脊髓损伤后罗哌卡因对脊髓锌指蛋白A20表达的影响目的本实验旨在通过研究罗哌卡因脊髓内注射损伤后,脊髓组织内锌脂蛋白A20的表达变化规律,探讨罗哌卡因与神经元继发性损害的相互关系。方法SD大鼠159只,体重150g-200g,雌雄不分。实验前12h禁食,可自由饮水。对照组：暴露脊髓硬膜后用29G针头行脊髓穿刺损伤,不作任何注射(n=36)；生理盐水组(A组)暴露脊髓硬膜后用29G针头行脊髓内注射生理盐水4μ1(n=41)；0.5%罗哌卡因组(B组)暴露脊髓硬膜后用29G针头行脊髓内注射0.5%罗哌卡因4μl(n=41)；2%罗哌卡因组(C组)暴露脊髓硬膜后用29G针头行脊髓内注射2%罗哌卡因4μl(n=41)。脊髓损伤针刺模型制备,同第二章。术中台灯照射保温,术毕肌注青霉素钠4万单位。大鼠分组饲养,每日检查有无局部感染。术后常规人工排尿2-3次,直至恢复自主膀胱。各组于术后8h、24h、72h、1w、2w时间点,各时点6只大鼠,行BBB评分、TFL和病理组织学观察。BBB评分,同第一章。用TFL检测仪测TFL。病理组织学观察：吸入3%七氟醚麻醉后,左心室插管,剪开右心耳,先用50ml生理盐水灌洗,再用40%甲醛50ml灌注,以穿刺损伤点为中心切取约10mm的脊髓,中性福尔马林固定48-72h,取穿刺部位,常规石蜡包埋,组织切片,HE染色。蛋白的免疫组化检测：切片标本采用S-P免疫组化染色试剂盒(三鹰生物技术有限公司),根据说明书进行染色。一抗A20单克隆抗体(大鼠来源IG1,美国ACTIVEMOTIF公司)浓度为1：300,二氨基联苯胺(DAB)显色。细胞质出现棕黄色颗粒为阳性结果。选取各组各时相点的切片染色,每时间点6只动物,每只动物随机取出3个层面,经与本实验不相关的2位工作人员光镜下计数每个层面阳性细胞数,取平均数即为每个标本平均阳性细胞数,并对各时间点6只动物进行统计。本研究各组SD大鼠数据以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 13.0统计软件包进行分析,组间比较采用完全随机设计资料的方差分析,组间多重比较采用LSD法。P<0.05为有统计学意义。结果所有大鼠无死亡,各组大鼠活动进食等无明显改变,实验A组、B组和C组大鼠当天进食少,精神欠佳；所有大鼠无后肢瘫痪和排尿困难。术后8h,所有大鼠都完全清醒。B组(0.5%罗哌卡因)、C组(2%罗哌卡因)与对照组比较72h前的BBB评分有统计学差异(P<0.05)。A组(0.9%NS)与对照组比较所有时间点均无统计学差异。2w各组大鼠脊髓运动功能均可恢复。HE染色：在脊髓穿刺损伤部位可见充血与水肿,以8h最明显,24h后逐步恢复。72h可见淋巴细胞、神经胶质细胞数目增加。1w时淋巴细胞数目逐步正常。2%罗哌卡因组可见少量的神经细胞坏死,但0.5%罗哌卡因组没有发现坏死的神经细胞。TFL的比较：术后8h,实验组与对照组间TFL比较无统计学差异。术后72h,0.5%罗哌卡因组和2%罗哌卡因组与对照组相比TFL延长,有统计学差异(P<0.05)。A组与对照组相比较无统计学差异。免疫组化染色结果：对照组各时间点脊髓组织可见少量神经元细胞胞质锌指蛋白A20阳性表达,实验组中A组、B组、C组三组均在术后8h可见A20表达阳性,锌指蛋白A20阳性表达程度：C组>B组>A组,三组至24h时A20阳性表达达到高峰值,各组1w时阳性表达无统计学差异。结论锌指蛋白A20是机体的一种重要的内源性抗炎因子,具有保护效应。罗哌卡因可诱发A20一过性高表达,对调控罗哌卡因作用于脊髓损伤后脊髓组织的炎症反应引发的继发性损伤具有重要保护意义,但由于A20作用时间短,不能完全抑制罗哌卡因对脊髓损伤后的脊髓组织的炎症反应。