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乙烯作为植物体内五大内源激素之一,其对植物叶、花的衰败、果实成熟及生长发育等生理过程起着重要的作用。源自微生物的ACC脱氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase,ACDS)可以将乙烯生物合成的直接前体物(ACC)分解成α-丁酮酸和氨,从而有效抑制乙烯的生物生成。本实验以矮牵牛为材料,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将ACDS基因(分别由组成型启动子CaMV35S、衰老特异表达启动子SAG12和花特异表达启动子CHSA驱动)转入矮牵牛,并对不同启动子驱动的ACDS基因获得转基因矮牵牛植株效率和转基因植株的生长速率进行初步分析,为利用基因工程技术培育延缓衰老的矮牵牛新品种奠定了必要的技术基础,得到以下结果:
1.建立了成熟的矮牵牛再生体系。通过梯度试验,研究了不同的激素水平对矮牵牛再生体系的影响,确定诱导愈伤组织的最适宜培养基为:MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.1m/L;诱导不定芽分化的最适宜培养基为:MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L;诱导生根的最适宜培养基为:MS+IBA0.05mg/L。
2.确定了卡那霉素和G418对矮牵牛的适宜筛选浓度。通过矮牵牛外植体对不同浓度抗生素的敏感性试验,得到的筛选浓度为:卡那霉素80mg/L,G41820mg/L。利用此浓度,对浸染后的矮牵牛进行抗性筛选。
3.分析了不同浓度的头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)对愈伤组织诱导率影响。结果表明Cef对叶片再生的影响较大,不宜用作抑菌剂,本实验选用Carb作为抑菌剂。
4.优化了农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系。结果表明预培养5d的矮牵牛叶盘在含AS 200μmol/L、OD600值为0.6的农杆菌菌液中浸染8 min后,共培养4d时遗传转化效果最优。最终获得抗性苗273株,其中CaMV35S启动子植株95株,SAG12启动子46株,CHSA启动子132株。
5.抗性植株的PCR鉴定。通过对矮牵牛抗性苗PCR分子检测,证明外源基因已整合到矮牵牛基因组中。共获得矮牵牛转基因株61株,其中携带CaMV35S启动子的31株、携带SAG12启动子的12株、携带CHSA启动子的18株。这些转基因植株有望成为培育抗衰老矮牵牛的基本材料。
6.不同启动子驱动的ACDS基因转化矮牵牛的差异。以CHSA启动子转化效率最高,达到3%;CaMV35S启动子次之,为2.35%;SAG12启动子最低,仅为1.25%。