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研究背景及目的:创伤、严重的骨感染和骨肿瘤等原因常常造成大段骨缺损,这些问题在临床上非常常见。目前自体骨移植仍是治疗大段骨缺损的常规方法,但是自体骨的来源容易受到供骨区取材的限制,并造成取骨区新的创伤。以间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为种子细胞构建的组织工程骨(Tissue-engineered bone,TEB)已经被广泛地研究和应用,被认为是治疗大段骨缺损最有希望的方法之一。大量的基础研究和临床应用已经证明,接种了间充质干细胞的组织工程骨比单纯的支架材料具有更好的骨修复效果,说明接种的种子细胞发挥了重要的作用。随着后续的研究发现,接种的间充质干细胞在组织工程骨移植到体内之后在短时间内大量的凋亡或者死亡,在最终形成新的骨组织中来源于种子细胞分化形成的比例较少。与此同时,在组织工程骨移植处会发现大量宿主自身的间充质干细胞被募集而来,参与骨修复。但是,这些宿主自身的间充质干细胞是如何被组织工程骨募集到骨缺损区域仍不十分清楚。课题组前期研究发现,组织工程骨移植后,在骨缺损移植区、外周血和骨髓形成一定的SDF-1浓度梯度,通过CXCR4受体募集宿主间充质干细胞到损伤区域,但是具体的作用机制并不明确。本文主要对组织工程骨和脱钙骨基质(Demineralized bone matrix,DBM)募集至骨缺损区域的宿主间充质干细胞进行转录组测序和生物信息学分析,并进一步研究SDF-1/CXCR4通路促进宿主间充质干细胞迁移至骨缺损区的机制。研究方法:(1)通过小动物活体成像和流式细胞学技术评估组织工程骨和脱钙骨基质募集外源性及宿主自身间充质干细胞能力的差异,利用流式分选技术分选迁移至大段骨缺损并移植TEB或DBM处的宿主间充质干细胞。通过提取RNA、建立cDNA文库和测序得到原始数据,然后和参考基因组比对,并计算基因的相对表达水平,筛选差异表达基因,进行GO富集分析,最后进行GSEA富集分析。(2)通过细胞迁移实验和QRT-PCR技术验证Rap1和Rac1在CXCR4介导的间充质干细胞迁移中的作用。(3)利用细胞迁移实验、QRT-PCR、免疫荧光和组织染色等技术验证Arpin在CXCR4介导的间充质干细胞迁移中的作用。研究结果:(1)相对于DBM,TEB会募集更多的间充质干细胞至骨缺损区域。RNA测序数据质量评估表明,提取的总RNA质量、建库质量以及测序深度较好,碱基分布均匀,测序质量达到分析要求。所得数据与参考基因组比对结果显示,所有样本的基因定位率大于94%;差异表达基因分析表明,在TEB组和DBM组之间,共有859个基因表达有差异,上调基因为284个,下调基因为575个。差异表达基因的GO富集结果显示,这些差异基因的功能主要涉及骨吸收的调节、骨髓细胞凋亡过程、破骨细胞分化的正调控、趋化因子受体活性和趋化因子结合等方面。GSEA富集结果显示,细胞因子及其相互作用通路被富集,TEB组CXCR4基因表达升高并在富集中发挥作用。(2)阻断Rap1和Rac1后MSCs向SDF-1的迁移减少,AMD3100阻断CXCR4后Rap1和Rac1的mRNA表达水平降低。(3)细胞迁移实验中,Arpin表达抑制组细胞迁移数量比空载体对照组高。“伤口愈合实验”中,Arpin表达抑制组比空载体对照组“伤口愈合”比例高。免疫荧光结果表示,术后2天,两组无明显差异,几乎无标记细胞迁移;术后7天,Arpin表达抑制组细胞迁移至移植区的数量更多。术后4周,Micro-CT结果显示,相对于空载体对照组,Arpin表达抑制组成骨质量更高,病理染色提示,Arpin表达抑制组存在更多的新生骨组织。结论:(1)组织工程骨和脱钙骨基质募集的宿主间充质干细胞的mRNA表达水平有差异,显著差异表达基因集中在趋化因子受体活性和趋化因子结合,细胞因子及其受体相互作用等通路被富集,TEB组CXCR4基因表达升高,可能与组织工程骨募集宿主间充质干细胞有关。(2)Rap1/Rac1、Arpin是CXCR4介导MSCs向趋化因子SDF-1迁移的下游分子,在间充质干细胞迁移至骨缺损区起作用。