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背景:宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大女性恶性肿瘤,严重威胁着女性的健康。据世界卫生组织估计,全球每年约有49万的新发病例,死亡率达到约47%。在中国,每年约有13.1万的新发宫颈癌病例,约占全世界新发病例的28.8%。近年来的统计数据显示,宫颈癌的发病和死亡年龄均出现年轻化趋势。宫颈癌的发生发展可划分为宫颈癌癌前病变(宫颈上皮内瘤变,cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌(cervical cancer,CC)两个阶段。高危型人类乳头瘤病毒(High Risk Human Papilomavirus,HR-HPV)持续感染是宫颈癌发生发展的必要条件之一。除此之外,宿主遗传因素在这一过程也发挥了重要作用。同时,细胞内多条信号通路参与了宫颈癌发生发展过程的调控,比如PI3K、MAPK、P53等。PI3K/AKT信号通路主要参与细胞增殖、分化、凋亡等过程的调控。研究发现,microRNA(miRNA)是PI3K/AKT信号通路中重要的调控分子,而在宫颈癌细胞中发现调控PI3K/AKT信号通路的miRNA表达出现异常。miRNA是一类小的约20-24个核苷酸组成的非编码单链RNA分子,通过碱基互补的方式与靶基因结合,引起靶基因mRNA的降解或翻译抑制。研究发现miRNA基因中位于pri-或pre-序列中的变异位点可能会影响miRNA剪切、加工和成熟过程从而影响成熟miRNA的表达,位于成熟miRNA序列中的变异可能会影响miRNA对靶基因的调控。综上所述,PI3K/AKT信号通路miRNA基因中的变异可能会通过影响成熟miRNA的表达或影响miRNA对靶基因的识别,从而影响PI3K/AKT信号通路的调控,在宫颈癌的发生发展中发挥作用。目的:寻找位于PI3K/AKT信号通路miRNA基因中的变异位点(单核苷酸多态性位点,Single nucleotide polymorphisms,SNPs),并分析 PI3K/AKT 信号通路 miRNA基因中的SNP位点与宫颈癌发生发展的相关性及其可能的机制,为宫颈癌发病机制的研究提供新的思路,为宫颈癌诊断治疗的研究提供新的靶标。方法:本研究首先通过miRPath数据库以及相关文献报道寻找与PI3K/AKT信号通路相关的miRNA,并通过序列测定寻找这些miRNA基因序列中的SNP位点。利用TaqMan Assay基因分型的方法和Massarray基因分型方法在416个健康对照个体、179例宫颈癌癌前病变患者和245例宫颈癌患者中对miRNA基因中的SNPs位点进行基因分型,获得SNPs位点在三组人群中的分布特征。通过卡方检验(χ2)分析这些SNPs位点等位基因、基因型在三组人群中的分布差异,应用逻辑回归分析寻找与宫颈癌发生发展具有相关性的SNPs位点,应用SNPstats软件分析各SNP与宫颈癌发生发展具有相关性的基因型。通过RNAfold等软件分析SNP对miRNA二级结构的影响,通过miRNA靶基因数据库(miRNAanda、Microcode、Targetscan、miRNATarget2、microT等)分析miRNA的靶基因,最后综合以上研究结果分析PI3K/AKT信号通路miRNA基因中的SNP位点与宫颈癌发生发展的相关性及其可能的机制。结果:1.PI3K/AKT信号通路miRNAs及靶基因:通过miRPath数据库以及相关文献报道获得PI3K/AKT信号通路相关的miRNA。通过靶基因预测以及文献报道我们进一步确认了 32个miRNA在PI3K通路上作用的靶基因。分别表示为:PI3K(miRNA-126 和miRNA-l0b),AKT(miRNA-7-]、miRNA-7-2、miRNA-7-3、miRNA-155、miRNA-125a、miRNA-124、let-7a2、miRNA-214、miRNA-424、miRNA-133a2、miRNA-145、miRNA-200b)miRNA-92a和miRNA-31),PTEN(miRNA-149、miRNA-21、miRNA-196a2、miRNA-3529、miRNA-499和 iRNA-106b),mTOR(miRNA-218-2、miRNA-218-1、miRNA-127、miRNA-100、miRNA-101-1 和 miRNA-101-2),CDK(miRNA-9-1、miRNA-9-2、let-7a2 和 miRNA-205),BAD(miRNA-106b),PDK(miRNA-23b 和 miRNA-155),p21(miRNA-125a),p27Kipl(miRNA-200b)。2.寻找miRNA基因中多态性位点:通过分析测序结果发现了位于14个miRNA基因中的18个多态性位点:rs4636297(pri-miRNA-126),rs531564(pri-miRNA-124),rs8111742(pri-miRNA-125a),rs6062251(pri-miRNA-133a),rs74693964、rs353292 和 rs353293(pri-miRNA-145),rs2292832(pre-miRNA-149),rs9660710(pri-miRNA-200b),rs629367 和 rs1143770(pri-let-7a2),rs4078756(miRNA-l0b启动子区),rs999885(miRNA-106b 启动子区),rs767649(pri-miRNA-155),rs11614913(miRNA-196a-3p),rs11134527(pri-miRNA-218),rs543412 和 rs1834306(pri-miRNA-100)。3.相关性分析结果:①miRNA-126基因中的SNP位点rs4636297的等位基因在对照组和癌前病变组中的分布频率以及对照组和宫颈癌组中的分布频率的差异经Bonferroni校正后具有统计学意义(P=0.005和P=0.036),该位点等位基因C在对照组中的分布频率显著高于癌前病变组(OR=0.507;95%CI:0.372-0.691)和癌症组(OR=0.637;95%CI:0.475-0.853),是宫颈癌发生的保护性因素。同样该位点基因型分布频率在对照组和癌前病变组的分布频率的差异经Bonferroni校正后具有统计学意义(P=0.004),但该位点基因型在对照组和宫颈癌组以及癌前病变组和宫颈癌组间分布频率的差异经Bonferroni校正后无统计学意义(P>0.05)。遗传模式的分析结果显示:在对照组和癌前病变组比较时,miRNA-126的SNP位点rs4636297的最优遗传模式为共显性遗传模式,在共显性遗传模式下C/C基因型可能会降低癌前病变的风险(P<0.002;OR=0.60,95%CI:0.41-0.88);在对照组和宫颈癌组比较时,该位点最优遗传模式是逻辑累加遗传模式,在该模式下2C/C-C/T可能会降低宫颈癌的患病风险(P=0.038,OR=0.62;95%CI:0.45-0.84)。② miRNA-149 的 SNP 位点rs2292832的等位基因C在对照组、癌前病变组以及宫颈癌组间分布频率的差异经Bonferroni校正后无统计学意义(P>0.05)。该位点基因型在对照组和癌前病变组中分布频率的差异经Bonferroni校正后具有统计学意义(P=0.036),但在对照组和宫颈癌组以及在癌前病变组和宫颈癌组的分布频率的差异经Bonferroni校正后均无统计学意义(P>0.05)。遗传模式的分析结果显示:在对照组和癌前病变组比较时该变异位点的最优遗传模式是超显性遗传模式,在该模式下T/T-C/C基因型可能会降低癌前病变发生的风险(P=0.001,OR=0.51;95%CI:0.34-0.75)。③其余位点(rs531564、rs8111742、rs6062251、rs74693964、rs353292、rs353293、rs96607]0、rs629367、rs1143770、rs4078756、rs999885、rs767649、rs11614913、rs11134527、rs543412和rs1834306)的等位基因和基因型在三组中的分布频率的差异经Bonferroni校正后均无统计学意义(P>0.05)。4.miRNA序列二级结构的预测结果:①miRNA-126二级结构预测结果显示携带rs4636297等位基因C的miRNA-126的二级结构较携带等位基因T的miRNA-126的二级结构稳定。②miRNA-149二级结构的预测结果显示携带rs2292832等位基因C的miRNA-149的二级结构相对于携带等位基因T的二级结构更加稳定。miRNA二级结构预测结果与相关性研究结果是相符的。结论:本研究结果显示miRNA-126基因中的SNP位点rs4636297等位基因C和基因型C/C可能是云南汉族人群宫颈癌发生的保护性因素。同样,miRNA-149基因中SNP位点的基因型T/T-C/C可能是云南汉族人群宫颈癌癌前病变发生的保护性因素。通过对miRNA二级结构的分析发现,miRNA-126基因中SNP位点rs4636297和miRNA-149 基因中的 SNP 位点 rs2292832 可以影响 pri-miRNA-126 和 pri-miRNA-149二级结构的稳定性。因此,这两个SNP位点可能是通过影响miRNA-126和miRNA-149剪切、加工和成熟过程而影响成熟miRNA的表达,差异表达的miRNA可能进一步影响了信号通路调控分子PI3K和PTEN的表达,最终影响PI3K/AKT信号通路的调控而在宫颈癌发生发展过程中发挥作用。