论文部分内容阅读
第一部分1,25(OH)2D3对促进NSCs增殖和向少突胶质细胞分化作用的实验研究 目的：（1）建立新生SD大鼠神经干细胞系，探讨不同浓度的1,25(OH)2D3对NSCs增殖的影响；（2）探讨1,25(OH)2D3对NSCs向少突胶质细胞分化的促进作用及最佳浓度。方法：（1）取新生SD大鼠大脑皮层，用无血清培养技术连续传代4次后行荧光鉴定，取第5代的NSCs处理成单细胞悬液，加入DMEM/F12完全培养基将细胞浓度调整为5.03105/ml后分成7个实验组，转移到24孔板上，每组6个孔，每孔500微升。A组：正常对照组（Normal control），仅含 DMEM/F12完全培养基；B组：溶媒对照组（ Vehicle control），含0.1％无水乙醇的DMEM/F12完全培养基；C组：溶媒对照组（Vehicle control），含1%无水乙醇的DMEM/F12完全培养基；D、E、F、G组：依次为含浓度10-8、10-7、10-6和10-5mol/l1,25(OH)2D3的DMEM/F12完全培养基。各组均在常规条件下培养七天，七天后将24孔板内的细胞球在光学显微镜下观察后按分组经离心、机械吹打将神经干细胞处理成单细胞悬液并更换完全培养基，每孔取一滴行台盼蓝染色计数活细胞数并统计学分析各组细胞增殖情况，然后加入抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50）行BrdU标记，统计阳性细胞率，统计学分析各组标记细胞数。（2）取第5代的NSCs处理成单细胞悬液，加入DMEM/HIGH GLUCOSE基础培养基将细胞浓度调整为5.03105/ml后转移到6孔板上，分成6个实验组，每组6个孔，每孔2毫升。A组：胎牛血清对照组（Normal control），含10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE基础培养基；B组：溶媒对照组（Vehicle control），含0.1%无水乙醇及10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE基础培养基；C、D、E组：依次为含浓度10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2D3的DMEM/HIGH GLUCOSE基础培养基。以上各组均在相同适宜的条件下诱导分化7天。7天后分别以一抗（兔抗大鼠Gal单克隆抗体，1:100）、二抗（山羊抗兔 IgG-FITC，1:100）染色处理并吹打重悬细胞分别转入测试管，流式细胞仪收集细胞分析10000个细胞，以阳性细胞数表示少突胶质细胞数量，阴性细胞数表示其他细胞数量。确定阳性细胞比例最高组后，按该浓度1,25(OH)2D3设实验组，同时设含10%胎牛血清的对照组，在6孔板上培养，每组12个孔，每个孔2毫升DMEM/HIGH GLUCOSE基础培养基，按照上述方法培养7天。七天后将实验组及对照组各取3孔组成1个小组，共4组，依次用一抗(兔抗大鼠 Nestin IgG,1:100、兔抗大鼠 NF-200抗体,1:100、兔抗大鼠 GFAP多克隆抗体,1:125、兔抗大鼠 Gal单克隆抗体,1:100）标记，然后用适宜浓度的二抗染色。将各组荧光染色的细胞，在倒置荧光显微镜下选取适宜激发的光线观察并照相。然后将孔板中的细胞经酶消化、机械吹打法处理成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.03105/ml，按照上述流式细胞仪检测的方法处理细胞后，将各组细胞行流式细胞仪分析，依次统计各组细胞的比例变化。结果：（1）台盼蓝计数统计数据表明，正常对照组、含0.1%无水乙醇溶媒对照组和10-8mol/l1,25(OH)2D3间未见明显统计学差异（P＞0.05），10-7和10-6浓度的1,25(OH)2D3能促进神经干细胞的增殖（P＜0.05），且10-6mol/l1,25(OH)2D3能使神经干细胞数量增殖最多，神经球体积更大、数量更多，但含1%无水乙醇的溶媒对照组和含10-5mol/l1,25(OH)2D3组细胞数量明显下降，与正常对照比较有统计学意义（P＜0.05）。BrdU标记结果同台盼蓝染色结果类似。正常对照组、含0.1%无水乙醇溶媒对照组和10-8mol/l1,25(OH)2D3组间未见明显统计学差异（ P＞0.05），10-6mol/l1,25(OH)2D3使神经干细胞增殖率最高。10-5mol/l1,25(OH)2D3组与含1%无水乙醇的溶媒对照组细胞增殖率均明显下降，而两组均含有1%无水乙醇，考虑细胞损害与无水乙醇含量过高有关，故在下述实验中将不再设置10-5mol/l的1,25(OH)2D3组。（2）1,25(OH)2D3促神经干细胞向少突胶质细胞分化实验结果表明，溶媒对照组和胎牛血清分化对照组间未见明显统计学差异（P＞0.05），而给予10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2D3处理后，分化出的少突胶质细胞比例增加，与胎牛血清分化组比较均有统计学的意义（均 P＜0.05），且随1,25(OH)2D3浓度的增加，1,25(OH)2D3促进NSCs向少突胶质细胞分化效果更加明显，1,25(OH)2D3浓度的达到10-6mol/l时使NSCs向少突胶质细胞的分化比例达到最大值。在1,25(OH)2D3浓度的达到10-6mol/l时，NSCs经诱导分化后各类型细胞的比例分别为：少突胶质细胞30.48±2.31%、神经元26.33±1.97%、星形胶质细胞30.58±2.03%、未分化的神经干细胞12.61±1.09%。结论：（1）1,25(OH)2D3具有促进NSCs增殖的作用，随着浓度增加NSCs细胞增殖数量增加，且10-6mol/l1,25(OH)2D3能使神经球数量增多、体积明显增大，神经干细胞增殖数量达到最大值。（2）1,25(OH)2D3具有促进NSCs向少突胶质细胞分化的生物学效应，随着浓度增加少突胶质细胞分化比例增大，在10-6mol/l时达到最大值，可使少突胶质细胞细胞的分化比例达到30.48±2.31%。 第二部分1,25(OH)2D3对缺血缺氧少突胶质细胞的保护作用 目的：构建少突胶质细胞体外缺血缺氧损伤模型，探讨不同浓度的1,25(OH)2D3对缺血缺氧的少突胶质细胞的保护作用；方法：选用少突胶质细胞分化比例最高组1,25(OH)2D3的浓度是10-6mol/l，在25cm2培养瓶里诱导分化少突胶质细胞，获取大量的细胞后，根据流式细胞仪检测到的荧光散射度或者发光度差异来分离细胞。将流式细胞仪分离提纯后的少突胶质细胞加入无糖平衡盐缓冲液调整到细胞浓度53105个/ml，分成7个实验组，转移到24孔板上每组6个孔，每孔500微升。A组：正常对照组（Normal control），仅含 DMEM/HIGH GLUCOSE完全培养基；B、C、D、E组：依次为含浓度10-9、10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2D3的无糖平衡盐缓冲液；F组：缺血缺氧对照组，等量无糖的平衡盐缓冲液；G组，溶媒对照组：0.1%无水乙醇+无糖的平衡盐缓冲液。其中缺血缺氧对照组、溶媒对照组和不同浓度的1,25(OH)2D3的实验组将采用糖氧剥夺（ oxygen glucose deprivation，OGD）法构建少突胶质细胞的体外缺血缺氧损伤的模型培养6个小时，正常对照组则是在适宜条件下培养6个小时。通过MTT比色法及流式细胞仪检测少突胶质细胞的细胞活力以及损伤凋亡状况。结果：同正常对照组比较，缺血缺氧对照组及溶媒对照组的少突胶质细胞的细胞活力明显降低，细胞凋亡率明显增高（均 P＜0.05），但缺血缺氧对照组与溶媒对照组组间比较上述指标无明显差异（均P＞0.05）；而1,25(OH)2D3实验组同缺血缺氧对照组比较，随着1,25(OH)2D3浓度升高少突胶质细胞的细胞活力增强，凋亡率减少，差异具有统计学意义。但10-7mol/l1,25(OH)2D3组和10-6mol/l1,25(OH)2D3组相较差异不明显（P＞0.05）；在增强细胞活力方面，10-9mol/l1,25(OH)2D3组和缺血缺氧对照组比较亦无显著性差异（P＞0.05）。结论：1,25(OH)2D3对缺血缺氧少突胶质细胞具有保护作用，且该作用具有浓度依赖性，最适浓度为10-7mol/l。